Разное

Срб в крови: С-реактивный белок (СРБ, CRP), показания к назначению, правила подготовки к сдаче анализа, расшифровка результатов и показатели нормы.

Содержание

С-реактивный белок (СРБ, CRP), показания к назначению, правила подготовки к сдаче анализа, расшифровка результатов и показатели нормы.

Подтверждаю Подробнее

  • ИНВИТРО
  • Библиотека
  • Лабораторная…
  • С-реактивный белок…

Ветряная оспа

Краснуха

Корь

Подагра

Энцефалит

Гепатит

Ревматизм

35151 06 Октября

Напоминаем вам, что самостоятельная интерпретация результатов недопустима, приведенная ниже информация носит исключительно справочный характер.

С-реактивный белок (СРБ, CRP): показания к назначению, правила подготовки к сдаче анализа, расшифровка результатов и показатели нормы.

Показания для назначения исследования

С-реактивный белок (СРБ) – наиболее высокочувствительный показатель повреждения тканей при воспалении, некрозе, травме. В крови здорового человека СРБ отсутствует или выявляется в минимальных количествах. Вырабатывается он преимущественно клетками печени (гепатоцитами), как реакция на попадание в организм человека возбудителей инфекций, на травму, а также при системных заболеваниях соединительной ткани (ревматических заболеваниях).

СРБ стимулирует иммунные реакции в организме, активирует его защитные системы и имеет высокую корреляцию с активностью заболевания и стадией процесса, то есть его концентрация становится тем выше, чем активнее воспаление (инфекционное или аутоиммунное) и более обширна зона повреждения тканей при некрозе или травме. Поэтому С-реактивный белок называют белком «острой фазы».

Еще одним показателем острого воспаления является СОЭ (скорость оседания эритроцитов).

СОЭ (Cкорость Оседания Эритроцитов, ESR)

СОЭ – неспецифичный маркер воспаления.  Синонимы: Реакция оседания эритроцитов; РОЭ.  Westergren sedimentation rate; Erythrocyte Sedimentation Rate; ESR; Sed Rate; Sedimentation Rate.  Кр…

До 1 рабочего дня

Доступно с выездом на дом

295 руб

В корзину

Однако СРБ более информативен, поскольку его уровень начинает расти раньше, а снижаться быстрее (при правильном лечении СРБ снижается на 6-10-е сутки, в то время как СОЭ – только на 14-28-е). Кроме того, на результаты СОЭ оказывает влияние пол пациента (у женщин показатель СОЭ выше, чем у мужчин), время суток, число эритроцитов, а на значениях СРБ это никак не отражается. Таким образом, для оценки воспалительного процесса анализ на С-реактивный белок выглядит более оправданным.

Уровень СРБ при вирусных заболеваниях повышается незначительно, поэтому его существенный рост в сочетании с повышенной температурой тела с большой долей вероятности свидетельствует о наличии бактериальной инфекции.

На короткое время С-реактивный белок может повышаться после оперативных вмешательств из-за повреждения тканей, но при отсутствии бактериального воспаления в послеоперационном периоде быстро снижается.

Тогда как присоединение бактериальной инфекции, будь то локальный процесс или сепсис, сопровождается ростом СРБ или отсутствием его снижения.

Существует высокочувствительный метод определения СРБ – высокочувствительный С-реактивный белок (кардио).

Исследование позволяет выявить повышение СРБ при вялотекущем, низкой степени активности воспалении внутренней поверхности сосудистой стенки, которое чревато образованием атеросклеротических бляшек. Анализ назначают только в отсутствии острых заболеваний и травм (при них повышение СРБ выявляется стандартным методом). Увеличение значений высокочувствительного С-реактивного белка может свидетельствовать о риске сердечно-сосудистых заболеваний: инфаркта миокарда, инсульта.

Таким образом, анализ на С-реактивный белок в комплексе с исследованием некоторых показателей клинического анализа крови (уровня лейкоцитов, лейкоцитарной формулы и СОЭ) обычно назначают в случае повышения температуры тела, чтобы по степени их увеличения предположить вирусное или бактериальное воспаление.

СРБ определяют при болях в суставах, не связанных с травмой, для дифференциальной диагностики дегенеративных и воспалительных заболеваний – артроза и артрита. При ревматических заболеваниях СРБ исследуют для оценки активности процесса и контроля эффективности лечения.

Подготовка к процедуре

Сдавать кровь предпочтительно утром натощак, после 8-14-часового перерыва в приеме пищи. Нельзя пить соки, чай и кофе. Воду пить разрешается.

При необходимости можно сдавать анализ на СРБ через 4-6 часов после легкого приема пищи.

За 2-3 дня до исследования следует исключить физические нагрузки.

Не следует курить минимум за 30 минут до забора крови.

С-реактивный белок (СРБ, CRP)

С-реактивный белок – белок острой фазы, чувствительный индикатор повреждения тканей при воспалении, некрозе, травме.  Синонимы: Анализ крови на СРБ; С-реактивн…

До 1 рабочего дня

Доступно с выездом на дом

665 руб

В корзину


Срок исполнения

Анализ выполняется в течение одного рабочего дня.

Что может повлиять на результаты

На результаты исследования может повлиять целый ряд факторов:

  • Интенсивные физические нагрузки, которые следует исключить за 2-3 дня до сдачи анализа, так как они могут приводить к повреждению мышечной ткани и, соответственно, повышению СРБ. Особенно это касается спортсменов и людей, регулярно посещающих спортзалы: любая травма мышц ведет к повышению уровня СРБ.
  • Прием обезболивающих и жаропонижающих средств из группы нестероидных противовоспалительных препаратов может снижать реально существующий уровень СРБ за счет уменьшения выраженности воспаления. Есть данные, что подобным действием обладают и статины, применяемые для снижения уровня холестерина в крови. 
  • Наличие имплантов и трансплантатов в организме. 
  • Употребление алкоголя и/или жирной пищи накануне исследования.

С-реактивный белок (СРБ, CRP)

Для исследования берется кровь из вены.

Сдать анализ крови на С-реактивный белок (СРБ, CRP) можно в ближайшем медицинском офисе ИНВИТРО. Список офисов, где принимается биоматериал для лабораторного исследования, представлен в разделе «Адреса».

Интерпретация результатов исследования содержит информацию для лечащего врача и не является диагнозом. Информацию из этого раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. Точный диагноз ставит врач, используя как результаты данного обследования, так и нужную информацию из других источников: анамнеза, результатов других обследований и т.д.

Нормальные показатели

Единицы измерения: мг/л

Нормальным считается уровень СРБ менее 5 мг/л.

При оценке сердечно-сосудистых рисков уровень высокочувствительного СРБ менее 1,0 мг/л расценивают как низкий, 1-3 мг/л – как средний, более 3 мг/л указывает на повышенный риск развития сердечно-сосудистых заболеваний в будущем.

Расшифровка показателей

Уровень С-реактивного белка в крови не зависит от пола и возраста пациента, а его повышение может быть связано с повреждением различной природы любых органов и систем организма. Конкретный диагноз устанавливается путем комплексной оценки жалоб, данных осмотра, инструментальных и лабораторных методов обследования.

Что значат пониженные показатели

Поскольку в крови здорового человека С-реактивный белок или отсутствует, или выявляется в минимальных количествах, говорить о его понижении некорректно.

Что значат повышенные показатели

Степень повышения С-реактивного белка обычно коррелирует с объемом, характером и выраженностью поражения тканей.

Повышение СРБ до 30 мг/л может говорить о вирусных заболеваниях — ОРВИ, ротавирусной инфекции и др., обнаруживается при злокачественных опухолях, ревматических болезнях вне стадии обострения (системная красная волчанка, дерматомиозит, системная склеродермия, ревматоидный артрит и др. ).

Повышение СРБ до 100 мг/л и выше, как правило, сопутствует различным острым бактериальным инфекциям (ангине, пневмонии, аппендициту, острому холециститу, пиелонефриту и др.), обострениям хронических инфекционных заболеваний и ревматических болезней, а также различным повреждениям тканей (оперативное вмешательство, инфаркт миокарда и т.д.).

Самое значимое повышение СРБ – до 300 мг/л и более возможно при обширных ожогах и сепсисе, когда бактерии из очага поражения попадают в кровь и распространяются по всему организму.

Дополнительное обследование при отклонении показателя от нормы

Подъем температуры тела в сочетании с повышением уровня С-реактивного белка может сопутствовать генерализованным (распространенным) и любым локальным поражениям – инфекциям кожи и подкожной жировой клетчатки, респираторным и стоматологическим инфекциям, инфекциям глаз, ЛОР-органов, желудочно-кишечного тракта, сердечно-сосудистой системы, урологическим инфекциям, инфекциям центральной нервной системы, костей и суставов.

В зависимости от клинической картины, обследованием и лечением таких пациентов занимаются врачи разных специальностей – терапевты, хирурги, узкие специалисты, в том числе ЛОРы, стоматологи, гинекологи, урологи, ревматологи.

В качестве дополнительных исследований в каждом конкретном случае может понадобиться самый разнообразный спектр инструментальной и лабораторной диагностики.

Повышение уровня высокочувствительного СРБ влечет за собой определение других факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний. Для этого выполняется анализ крови на липидный спектр, фибриноген, гомоцистеин, глюкозу, мочевую кислоту, а также ультразвуковое исследование сосудов шеи и сердца.

Источники

  1. Ершов А.В. С-реактивный белок в диагностике внебольничной пневмонии. Consilium Medicum, журнал. 2019, 21(3): 15-19 с.
  2. Хоролец Е.В., и соавт. Диагностическая значимость С-реактивного белка в генезе патологий сердечно-сосудистой системы. Журнал фундаментальной медицины и биологии. № 1. 2013. С. 23-27.

ВАЖНО!

Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.
Для корректной оценки результатов ваших анализов в динамике предпочтительно делать исследования в одной и той же лаборатории, так как в разных лабораториях для выполнения одноименных анализов могут применяться разные методы исследования и единицы измерения.


Рекомендации

  • Анализ на ПСА (простатический специфический антиген)

    6817 13 Мая

  • Вирус папилломы человека

    13217 04 Мая

  • Щелочная фосфатаза

    12846 16 Апреля

Показать еще

Похожие статьи

Желтуха

Гепатит

Антитела к вирусу гепатита В

Антитела к вирусу гепатита В: показания к назначению, правила подготовки к сдаче анализа, расшифровка результатов и показатели нормы.

Подробнее

Тиреотоксикоз

Гепатит

Сахарный диабет

Глюкоза (в крови) (Glucose)

Глюкоза (в крови) (Glucose): показания к назначению, правила подготовки к сдаче анализа, расшифровка результатов и показатели нормы.

Подробнее

Подагра

Сахарный диабет

Атеросклероз

Мочевая кислота (в крови) (Uric acid)

Мочевая кислота в крови: показания к назначению, правила подготовки к сдаче анализа, расшифровка результатов и показатели нормы.

Подробнее

Краснуха

Герпес

Лабораторные исследования во время беременности — TORCH-инфекции

Токсоплазмоз. Лабораторная диагностика токсоплазмоза основана только на определении специфических антител, так как антиген Toxoplasma gondii присутствует в крови очень непродолжительное время. При попадании возбудителя в организм человека в течение 7 — 14 дней начинается первичный иммунный ответ-выработка IgM антител. Максимальный уровень IgM антител достигается к 20-му дню от начала заболевания. Полное их исчезновение в большинстве случаев происходит в течение 3 — 4 месяцев. В этот же период в крови отмечаются максимальные значения IgG антител. После выздоровления происходит постепенное снижение титра IgG антител до определённого уровня, который сохраняется пожизненно и свидетельствует о наличии устойчивого иммунитета.

Подробнее

Пиелонефрит

Гепатит

Цистит

Сахарный диабет

Анализ мочи общий (Анализ мочи с микроскопией осадка)

Анализ мочи общий: показания к назначению, правила подготовки к сдаче анализа, расшифровка результатов и показатели нормы.

Подробнее

Подпишитесь на наши рассылки

Введите e-mail

Даю согласие на обработку персональных данных

Подписаться

Сдать анализ крови на СРБ, С-реактивный белок

Метод определения Иммунотурбидиметрический высокочувствительный (нижний предел обнаружения – 0,1 мг/л).

Исследуемый материал Сыворотка крови

Доступен выезд на дом

Онлайн-регистрация

С-реактивный белок – белок острой фазы, чувствительный индикатор повреждения тканей при воспалении, некрозе, травме. 

Синонимы: Анализ крови на СРБ; С-реактивный белок сыворотки крови.
C-reactive Protein (CRP), quantitative; C-reactive protein test; CRP test. 

Краткое описание определяемого вещества С-реактивный белок 

С-реактивный белок (СРБ) – пентамерный белок, синтезируемый преимущественно в печени. Получил свое название из-за способности вступать в реакцию преципитации с С-полисахаридом пневмококков (важный элемент ранней защиты от инфекции). СРБ стимулирует реакции врожденного иммунитета, в том числе фагоцитоз, участвует во взаимодействии Т- и В-лимфоцитов, активирует систему комплемента по классическому типу.  

Уровень СРБ существенно повышается при развитии воспалительных процессов (при инфекциях, травмах, некрозе тканей, воспалительных заболеваниях), в связи с чем он отнесен к белкам острой фазы воспаления, среди которых был описан первым. С-реактивный белок ассоциирован и с различными хроническими воспалительными процессами. При воспалении лейкоциты начинают вырабатывать цитокины, действие которых усиливает синтез С-реактивного белка, что приводит к повышению его уровня в крови. СРБ характеризуется способностью к кальций-зависимому связыванию с различными лигандами – в частности, фосфохолиновыми остатками, но также многими другими лигандами внутреннего и внешнего происхождения. К ним относится ряд фосфолипидов и родственных соединений, компоненты поврежденных клеточных мембран, модифицированных и нативных липопротеинов, нуклеопротеиновые частицы, апоптотические клетки, а также полисахариды и иные компоненты клеточных стенок и мембран микроорганизмов – бактерий, грибов, паразитов. Образование комплексов СРБ с компонентами поврежденных тканей или микроорганизмов активирует классический каскад комплемента, инициируя опсонизацию, фагоцитоз и лизис патогенов, удаление поврежденных клеток.  

При каких состояниях может повышаться уровень С-реактивного белка 

С-реактивный белок – центральный белок острой фазы. 

Его уровень коррелирует со стадией и тяжестью заболевания и используется в качестве лабораторного маркера для оценки выраженности воспалительных процессов, наблюдения за их динамикой, для дифференциальной диагностики бактериальных и вирусных инфекций, выбора адекватного лечения и контроля его эффективности. Концентрация С-реактивного белка в сыворотке возрастает быстро (в первые 6-8 часов) и значительно (в 20-100 раз) при заболеваниях, связанных с повреждением тканей, воспалением, инфекцией или развитием злокачественного процесса. При успешном выздоровлении его уровень быстро снижается. 

Бактериальные инфекции сопровождаются повышением уровня С-реактивного белка в сыворотке более чем в 15 раз. При тяжелых генерализованных инфекциях, ожогах, сепсисе уровень С-реактивного белка может достигать очень высокого значения, превышающего норму в 60 раз и более.  

Значительное повышение содержания СРБ отмечается при заболеваниях, сопровождаемых повреждением тканей, например, при инфаркте миокарда и остром панкреатите. 

После хирургических вмешательств уровень С-реактивного белка в сыворотке повышается в раннем послеоперационном периоде, но быстро снижается при отсутствии инфекционных осложнений. 

Повышение уровня С-реактивного белка используют как индикатор воспалительных процессов для оценки течения ревматоидного артрита и болезни Крона. 

Что может повлиять на результат исследования крови на С-реактивный белок 

К повышению уровня С-реактивного белка могут приводить курение и ожирение. На уровень СРБ не оказывают особого влияния изменения гормонального статуса, в том числе и во время беременности. 

С какой целью проводят исследование крови на С-реактивный белок 

Исследование СРБ в сыворотке крови применяют в целях выявления воспаления, оценки остроты и тяжести болезни, контроля лечения различных воспалительных заболеваний. По диагностической значимости СРБ превосходит СОЭ, поскольку уровень СРБ растет и снижается быстрее 

Относительно новая область применения этого показателя – оценка риска развития атеросклероза и связанных с ним осложнений. Современные высокочувствительные методы определения СРБ (чувствительность < 0,5 мг/л), могут улавливать изменение СРБ не только в условиях острого, но также и хронического, низкой степени выраженности, эндогенного воспаления (см. отдельный тест для использования в целях оценки кардиорисков № 1643).

Анализ сульфородамина B (SRB) в клеточной культуре для исследования клеточной пролиферации

  • Список журналов
  • Рукописи авторов HHS
  • PMC5448418

Биопроток. Авторская рукопись; доступно в PMC 2017 30 мая.

Опубликовано в окончательной редакции как:

Bio Protoc. 2016 5 ноября; 6(21): e1984.

doi: 10.21769/BioProtoc.1984

PMCID: PMC5448418

NIHMSID: NIHMS844985

PMID: 28573164

1, 2 and 1, *

Author information Copyright and License information Disclaimer

Анализ SRB использовался с момента его разработки в 1990 году (Skehan et al. , 1990) для недорогого проведения различных скрининговых анализов для изучения цитотоксичности в клеточных исследованиях (Vichai and Kirtikara, 2006). Этот метод основан на свойстве SRB, который стехиометрически связывается с белками в умеренно кислых условиях, а затем может быть экстрагирован в щелочных условиях; таким образом, количество связанного красителя можно использовать в качестве показателя клеточной массы, который затем можно экстраполировать для измерения клеточной пролиферации.

Протокол можно разделить на четыре основных этапа: подготовка лечения, инкубация клеток с лечением по выбору, фиксация клеток и окрашивание SRB, а также измерение поглощения. Этот анализ ограничен ручным или полуавтоматическим скринингом и может использоваться эффективным и чувствительным образом для тестирования химиотерапевтических препаратов или малых молекул в прикрепленных клетках. Он также имеет применение для оценки эффектов модуляции экспрессии генов (нокдаун, усиление экспрессии генов), а также для изучения эффектов замены микроРНК на пролиферацию клеток (Kasinski 9).0013 и др. , 2015).

Анализ SRB широко используется для изучения цитотоксичности в клеточных исследованиях, и это метод выбора для высокорентабельных скринингов (Vichai and Kirtikara, 2006). Поскольку этот метод не основан на измерении метаболической активности [, например, ., 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид, МТТ], шаги, необходимые для оптимизации протокола для конкретного клеточная линия существенно упрощена.

Описанный здесь протокол был оптимизирован для скрининга средней пропускной способности миРНК с опухолесупрессивными свойствами в прикрепленных клетках рака легкого в 96-луночный формат и 384-луночный формат (Kasinski et al. , 2015). В частности, анализ SRB в 384-луночном формате предлагает преимущество скрининга большого количества миметиков микроРНК или соединений в одном планшете (> 60 на планшет, 6 повторов) с использованием недорогого оборудования и реагентов.

  1. 96-луночные прозрачные плоскодонные полистироловые планшеты для тканевых культур (Corning, каталожный номер: 3596)

  2. 384-луночные прозрачные плоскодонные полистироловые планшеты для тканевых культур (Corning, каталожный номер: 3701)

  3. 96-луночные планшеты для ПЦР (Corning, Axygen ® , каталожный номер: PCR-96-FS-C)

  4. 100-мм планшеты для тканевых культур (Corning, каталожный номер: 430167

    Пробирки Eppendorf на 1,5 мл (VWR, каталожный номер: 89000-028)

  5. Пробирки Falcon на 15 мл (Corning, Falcon ® , каталожный номер: 352097)

  6. RT-L10FLR)

  7. Наконечники для пипеток (Mettler-Toledo International, каталожные номера: RT-L200F)

  8. Наконечники для пипеток (Mettler-Toledo International, каталожные номера: RT-L1000F)

  9. Matrix ™ наконечники для пипеток (1,2 мкл) Thermo Fisher Scientific, Thermo Scientific ™ , каталожные номера: 8245)

  10. Matrix ™ наконечники для пипеток (125 мкл) (Thermo Fisher Scientific, Thermo Scientific ™ , каталожные номера: 7445)

    03

    Аккуменная клеточная линия

  11. Соответствующая культуральная среда

  12. Реагентный резервуар стерильный (Corning, Costar ® , Номер каталога: 4870)

  13. Реагент. 684)

  14. Opti-MEM ® (Thermo Fisher Scientific, Gibco ™ , каталожный номер: 31985070) или бессывороточная среда (SFM, подходящая культуральная среда перед добавлением эмбриональной бычьей сыворотки)

  15. Фосфатно-солевой буфер (PBS) (GE Healthcare, каталожный номер: Sh40256)

  16. Раствор трипсина (2,5%, вес/объем) (GE Healthcare, каталожный номер: Sh40042.01)

    17. 3

    3 Fatal b сыворотка (FBS) (Sigma-Aldrich, каталожный номер: F2442)

  17. Трипановый синий (Sigma-Aldrich, каталожный номер: T9154)

  18. Трихлоруксусная кислота (TCA) (Sigma-Aldrich, каталожный номер: 91228)

  19. Натриевая соль сульфородамина Б (SRB) (Sigma-Aldrich, каталожный номер: S1402) в 1% (об./об.) уксусной кислоте

  20. Уксусная кислота (Thermo Fisher Scientific, Fisher Scientific, каталожный номер: S25118)

  21. 10 мМ небуферный раствор трис-основы (Sigma-Aldrich) ™ , каталожный номер: AM9932)

  22. Липофектамин РНКимакс (Thermo Fisher Scientific, Invitrogen ™ , каталожный номер: 13778150)

  23. Fisher Scientific, миметики миРНК Mirvana0027 ™ )

  24. Молекулы-предшественники миРНК — отрицательный контроль № 2 (нецелевая скремблированная миРНК) (Thermo Fisher Scientific, Ambion ™ , каталожный номер: AM17111)

    25. 3
      , каталожные номера: L-1000XLS)

    1. Пипетки (Mettler-Toledo International, каталожные номера: L200-XLS)

    2. Пипетки (Mettler-Toledo International, каталожные номера: L20-XLS)

    3. Пипетки (Mettler-Toledo International, каталожные номера: L2-XLS)

    4. Многоканальные пипетки (Mettler-Toledo International, каталожные номера: L12-200XLS)

    5. Многоканальные пипетки (Mettler-Toledo International, каталожные номера: L12-20XLS)

    6. Matrix ™ Многоканальная электронная пипетка (384-луночный формат) (Thermo Fisher Scientific, Thermo Scientific ™ , каталожные номера: 2011)

    7. Matrix ™ Многоканальная электронная пипетка (96-луночный формат) (Thermo Fisher Scientific, Thermo Scientific ™ , каталожные номера: 2004)

    8. Инвертированный микроскоп (Nikon, модель: TS100)

    9. Многолуночный считыватель микропланшетов (Glomax, Promega)

    10. Гематоцитометр (Hausser Scientific, Bright-Line 8, 9 номер по каталогу: 4 ™ 9 902)

    1. Программное обеспечение для статистического анализа (GraphPad Prism, SPSS)

    ; конечный объем в лунке 100 мкл) или шесть повторов в 384-луночных планшетах (10 мкл на повтор; конечный объем в лунке 20 мкл), а также учитывают вариации пипетирования.

  25. Препарат можно приготовить в водном растворе (Opti-MEM для трансфекции) или растворителе по выбору ( напр. , ДМСО).

B. Подготовка клеток

  1. Удалите среду из клеточных монослоев и один раз промойте клетки стерилизованным PBS.

  2. Удалите PBS и добавьте 1 мл (100-мм чашки) 0,25% (вес/объем) трипсина, чтобы равномерно покрыть поверхность роста клеток.

  3. Инкубировать при 37 °C в течение 5 минут или до тех пор, пока клетки не начнут диссоциировать.

  4. Затем инактивируйте трипсин 10 объемами культуральной среды, содержащей FBS, и перемешайте до получения гомогенной суспензии отдельных клеток.

  5. Перенесите суспензию клеток в стерильную пробирку Falcon. Определите концентрацию клеток путем подсчета в камере гематоцитометра под микроскопом, используя смесь 1:1 клеточной суспензии и 0,4% (вес/объем) раствора трипанового синего для определения жизнеспособности клеток до посева клеток. Необязательно: перед подсчетом, центрифугируйте клетки, чтобы отмыть трипсин и ресуспендировать в питательной среде.

    Примечание: переходите к следующим шагам только в том случае, если клетки в растворе выглядят здоровыми, проверяя окрашивание трипановым синим ( ).

    Открыть в отдельном окне

    Окрашивание трипановым синим клеток эпителия бронхов человека (HBEC)

    Стрелка указывает на окрашенную клетку, указывающую на то, что она мертва. Живая клетка под ним имеет неповрежденную мембрану и поэтому не окрашена.

  6. Отрегулируйте концентрацию клеток с помощью питательной среды (10% FBS) для получения подходящей плотности высева клеток на лунку в объеме 50 мкл (96-луночный формат) или 10 мкл (384-луночный формат).

    Примечание. Начальная плотность посева клеток будет зависеть от двух основных факторов: 1) времени удвоения используемой клеточной линии и 2) дня, когда будут считываться данные с планшета. Клетки обычно имеют 70–80% слияния (2 × 10 4 для 96-луночного формата и 8 × 10 3 для 384-луночного формата) к концу эксперимента (день 5).

  7. Перенесите клеточную суспензию в стерильный резервуар для реагентов, чтобы упростить пипетирование с помощью многоканальной пипетки.

C. Лечебное воздействие

  1. Смешайте лечебные растворы, приготовленные на шаге А, с помощью пипетки. В каждую лунку внесите по 50 мкл (96-луночный формат) или 10 мкл (384-луночный формат) раствора.

  2. Тщательно перемешайте клеточную суспензию, приготовленную на этапе B, и добавьте 50 мкл (96-луночный формат) или 10 мкл (384-луночный формат) в каждую лунку, уже содержащую лечебные растворы.

    Примечание. Обеспечьте равномерное распределение клеток на дне планшета и избегайте встряхивания планшета во избежание «эффекта кольца». Лучший способ добиться этого — добавить клеточный раствор прямо на дно лунки, не касаясь стенок. Мы также рекомендуем выполнить короткое вращение планшета (20 секунд, 10 × g) перед помещением его в инкубатор.

  3. Отложите три лунки в планшете, содержащие только Opti-MEM или выбранный растворитель и клеточную суспензию для контроля необработанных клеток или носителя. Кроме того, оставьте три лунки в планшете, содержащие только среду для вычитания фона.

  4. Инкубируйте планшет при 37 °C во влажном инкубаторе с 5% CO 2 до тех пор, пока планшет не будет считываться.

    Примечание. Время инкубации будет зависеть от типа тестируемого соединения и должно быть определено экспериментально. Например, в наших руках мы наблюдаем самую большую разницу в пролиферации клеток между отрицательным контролем и миРНК, подавляющей опухоль, через 5 дней после трансфекции.

D. Фиксация и окрашивание клеток

  1. Аккуратно добавьте 25 мкл (96-луночный формат) или 5 мкл (384-луночный формат) холодной 50% (масса/объем) ТХУ в каждую лунку непосредственно в супернатант среды, и инкубировать пластины при 4 ° C в течение 1 часа. Смешивание не требуется, так как это может привести к отделению некоторых клеток от дна лунки.

    Промойте планшеты четыре раза, погрузив их в ванну с медленно текущей водой из-под крана, и удалите лишнюю воду, осторожно постучав планшеты по бумажному полотенцу. После последней стирки дайте пластине высохнуть на воздухе при комнатной температуре.

    Примечание: Отслоение клеточного монослоя может произойти, если в лунки нагнетается вода. Мы рекомендуем дать пластине полностью высохнуть, прежде чем переходить к следующему шагу. При необходимости высушенные пластины можно хранить при комнатной температуре неограниченное время.

  2. Добавьте 50 мкл (96-луночный формат) или 20 мкл (384-луночный формат) 0,04% (вес/объем) раствора SRB в каждую лунку.

    Примечание. Убедитесь, что раствор находится в непосредственном контакте со дном лунки и что между ними нет пузырьков. 9Раствор 0014 SRB не чувствителен к свету, поэтому планшет не нужно накрывать во время инкубации.

  3. Оставьте при комнатной температуре на 1 час, а затем быстро промойте планшеты четыре раза 1% (об./об.) уксусной кислотой (200 мкл для 96-луночного формата или 30 мкл для 384-луночного формата) для удаления несвязавшегося красителя. . Дайте пластине высохнуть на воздухе при комнатной температуре.

    Примечание. Неоднородные промывки являются основным источником ошибок в этом анализе. Смывки должны производиться быстро и равномерно по всей пластине. Это особенно важно для 384-луночного формата. Небольшая площадь лунок приводит к высокому поверхностному натяжению, что иногда затрудняет равномерную промывку планшетов. Визуально проверьте, чтобы во все лунки планшета была введена 1% (объемная) уксусная кислота и что нет пузырьков, препятствующих промывке. Мы рекомендуем промывать многоканальной пипеткой и вводить раствор в лунки непрямо через стенки лунок.

E. Измерение абсорбции

  1. Добавьте от 50 мкл до 100 мкл 10 мМ раствора трис-основы (рН 10,5) в каждую лунку и встряхивайте планшет на орбитальном шейкере в течение 10 мин для растворения связанного с белком красителя ( примерно 10 мин).

  2. Измерьте оптическую плотность при 510 нм в ридере для микропланшетов.

Вычтите фоновое поглощение из всех лунок. Рассчитайте процент лечения, нормализующего ингибирование клеточного роста, к отрицательному контролю микроРНК, используя следующую формулу:

% роста клеток = образец поглощения/отрицательный контроль поглощения или необработанный × 100()

% ингибирование роста = 100 — % роста клеток

Открыть в отдельном окне

A. Титрование числа клеток (h541) с использованием формата анализа SRB, 384-луночный формат, n = 6, планки погрешностей = SD. B. Анализ доза-эффект миР-34a в клеточных линиях рака легкого h541 и h458 с использованием 96-луночного формата SRB, n = 3,

Результаты анализа SRB можно использовать только в том случае, если данные находятся в пределах линейности анализа. Мы рекомендуем провести эксперимент по титрованию числа клеток, чтобы определить линейный динамический диапазон анализа с используемой клеточной линией (). Как правило, О.Д. > 2 не входят в линейный диапазон анализа.

Статистические тесты для этого типа анализа могут включать t — тесты для сравнения двух групп или ANOVA для сравнения нескольких групп.

  1. По нашему опыту, использование многоканальных электронных пипеток для анализов в 384-луночном формате снижает вариации из-за ошибок пипетирования. Для этой цели настоятельно рекомендуется готовить комплексы миРНК-липосомы в 96-луночные планшеты для ПЦР, что позволит использовать многоканальные пипетки.

  2. Плотность посева будет зависеть от времени удвоения используемой клеточной линии, а также от дня считывания. Как правило, клетки не должны достигать 100% слияния ко дню считывания. Исходя из нашего опыта, окончательная конфлюэнтность 80% обеспечивает удовлетворительные результаты с клеточными линиями немелкоклеточного рака легкого (, например, , h541, A549, EKVX).

  3. День фиксации после лечения также необходимо определить эмпирически. По нашему опыту, 4–6 дней после трансфекции миметиков микроРНК дают удовлетворительные результаты в клеточных линиях немелкоклеточного рака легкого, демонстрируя максимальное ингибирование роста по сравнению с контролем.

  4. Для трансфекции миРНК:

    1. Комплексы миРНК-липосомы можно приготовить в среде, не содержащей сыворотки/антибиотиков.

    2. Количество Lipofectamine RNAimax должно быть определено эмпирически для каждой используемой клеточной линии, чтобы определить количество реагента, обеспечивающее максимальную эффективность трансфекции и минимальную клеточную токсичность. Это устраняет необходимость смены среды после трансфекции, что является распространенным источником вариаций в этих типах анализов.

    3. В наших руках мы определили, что 0,12 мкл (для 96-луночных планшетов — 100 мкл) или 0,05 мкл (для 96-луночных планшетов — 20 мкл) Lipofectamine RNAimax достаточно для трансфекции 6 нМ микроРНК-миметика с минимальным токсичность в панели клеток немелкоклеточного рака легкого. Каждая трансфекция должна быть воспроизведена в одном и том же планшете (мы рекомендуем по крайней мере 3 повторения в 96-луночном планшете или 6 в 384-луночном планшете).

    4. Исходя из нашего опыта, обратная трансфекция сокращает время анализа и в то же время уменьшает источники вариаций при смене среды перед трансфекцией, этапах промывки и замене Opti-MEM после трансфекции.

Представленный здесь протокол был адаптирован из Kasinski et al. (2015). Эта работа была поддержана грантом NIH (R00CA178091 и P30CA023168).

1. Касински А.Л., Келнар К., Штальхут С., Орельяна Э., Чжао Дж., Шимер Э., Дайсарт С., Чен Х., Бадер А.Г., Слэк Ф.Дж. Комбинаторный подход к терапии микроРНК для подавления немелкоклеточного рака легкого. Онкоген. 2015;34(27):3547–3555. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

2. Skehan P, Storeng R, Scudiero D, Monks A, McMahon J, Vistica D, Warren JT, Bokesch H, Kenney S, Boyd MR. Новый колориметрический анализ цитотоксичности для скрининга противоопухолевых препаратов. J Natl Cancer Inst. 1990;82(13):1107–1112. [PubMed] [Google Scholar]

3. Vichai V, Kirtikara K. Колориметрический анализ сульфородамина B для скрининга цитотоксичности. Нат Проток. 2006;1(3):1112–1116. [PubMed] [Академия Google]

Сульфородамин B (SRB) Анализ клеточной цитотоксичности — Creative Bioarray

Введение

Сульфородамин B (SRB) представляет собой ярко-розовый аминоксантеновый краситель с двумя сульфоновыми группами, который может образовывать электростатический комплекс с основными аминокислотными остатками в слегка кислых условиях. , но он может диссоциировать при основных условиях. Поскольку связывание SRB является стехиометрическим, количество включенного красителя, высвобождаемого из окрашенных клеток после промывания, прямо пропорционально массе клеток и может быть измерено при 565 нм.

Анализ клеточной цитотоксичности сульфородамина B (SRB) широко используется для скрининга лекарственной токсичности и обнаружения клеточной пролиферации в отношении различных типов раковых и нераковых клеточных линий. Кроме того, этот анализ не зависит от метаболической активности клеток и, следовательно, оказывает меньшее влияние на тестируемые соединения. Описанный здесь протокол был оптимизирован для скрининга токсичности соединений для прикрепленных клеток в 96-луночном формате.

Характеристики

  • Чувствительный
  • Легко в использовании
  • Воспроизводимый
  • Великая линейность
  • Стабильная конечная точка
  • Хорошее отношение сигнал / новое. In vitro исследования клеточной токсичности и пролиферации

Материалы

  • Соответствующая культуральная среда
  • Раствор трипсина
  • Диметилсульфоксид (ДМСО)
  • Фиксационный раствор
  • Раствор для промывки
  • раствор раствора
  • Раствор красителя SRB
  • Доксорубицин
  • Раствор фосфатного буфера (PBS)
  • 96-луночная пластина
  • Spectrophoter

1010303050303030303050530303030303030505050505303050503.

  • Культура клеток
    1) Удалите среду и один раз промойте клетки стерилизованным PBS.
    2) Трипсинизируйте и раскрутите клетки.
    3) Добавьте 5 мл питательной среды для диспергирования клеток и определите плотность клеток с помощью гемоцитометра.
    4) Добавьте питательную среду, чтобы отрегулировать концентрацию клеток и получить соответствующую плотность посева.
    5) Добавьте 200 мкл клеток с рекомендуемой плотностью от 5 000 до 20 000 клеток/лунку в 96-луночный планшет.
  • Обработка соединениями
    1) Подготовьте серийные разведения испытуемых соединений соответствующим образом, используя ДМСО в качестве растворителя, и добавьте соединения в экспериментальные лунки.
    2) Подготовьте лунку, содержащую только ДМСО, в качестве контроля, и другую лунку, содержащую только культуральную среду, в качестве фонового контроля. Кроме того, добавьте 1 мкл 20 мМ доксорубицина в лунку, содержащую клетки в качестве контроля ингибитора.
    3) Инкубируйте планшет при 37°C во влажном инкубаторе с 5% CO 2  в течение 72 часов.
  • Фиксация клеток
    1) Не удаляя культуральный супернатант, добавьте в каждую лунку по 50 мкл фиксирующего раствора.
    2) Инкубируйте планшет в течение 1 часа при 4°C, затем удалите раствор и промойте лунки 3 раза.
    Примечание. Промывать следует как можно бережнее, чтобы не нарушить клеточный монослой.
    3) Максимально удалить промывочные растворы с помощью пипетки.
    Примечание. После завершения этапов фиксации клеток, промывки и сушки планшет можно при желании хранить при комнатной температуре в течение месяца.
  • Окрашивание SRB
    1) Добавьте по 45 мкл раствора SRB в каждую лунку и окрашивайте в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте.
    Примечание. SRB следует защищать от света, так как он чувствителен к свету.
    2) После инкубации удалите окрашивающий раствор и добавьте 200 мкл промывочного раствора для промывки 4 раза.
    Примечание. Стирать следует как можно быстрее, чтобы избежать отбеливания.
    3) Максимально удалите промывочные растворы с помощью пипетки и при необходимости высушите планшет на воздухе.
  • Солюбилизация
    1) Добавьте 200 мкл раствора для солюбилизации в каждую лунку.
    2) Встряхните планшет или поместите планшет на шейкер на 10 мин при комнатной температуре.
  • Измерение
    1) Измерьте ОП при 565 нм.
    2) Если наблюдается интенсивный цвет (> OD 3,5), вы можете использовать субоптимальную длину волны (, например,  490-530 нм), чтобы снизить показания до линейного диапазона вашего прибора.
  • Расчет
    1) Правильный расчет путем вычитания OD контроля, содержащего только питательную среду (лунку фонового контроля), из показаний всех образцов.
    2) Рассчитайте процент цитотоксичности по приведенной ниже формуле:

Ссылки

  1. Orellana E.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *