Биологическая роль серы: Ошибка 404. Запрашиваемая страница не найдена

Упрощенная диаграмма, которая изображает взаимосвязь между SAA, синтезом GAG, хранением цистеина в виде глутатиона, синтезом белка и метаболизмом азота.

У крыс, подвергшихся недостаточному потреблению серы для изучения сульфатирования ацетаминофена с целью биодеградации, наблюдались изменения гомеостаза PAPS [15]. Одновременно эти животные выводили ацетаминофен из крови более медленными темпами и превращали его в токсичный промежуточный тиоэфир.Снижение сульфатирования, по-видимому, вызвано снижением доступности неорганического сульфата для синтеза PAPS.

Глутатион (GSH) ключевой метаболит и форма хранения серы

Аминокислоты серы вносят существенный вклад в поддержание и целостность клеточных систем, влияя на окислительно-восстановительное состояние клеток и способность выводить токсичные соединения, свободные радикалы и активные формы кислорода [ 16]. Цистеин и метионин не накапливаются в организме. Любой избыток пищи легко окисляется до сульфата, выводится с мочой (или реабсорбируется в зависимости от диетических уровней) или сохраняется в форме глутатиона (GSH).Даже в экстремальных ситуациях, например, когда дефицит триптофана приводит к общему катаболическому эффекту, организм пытается сэкономить потерю серы, продолжая хранить любую доступную серу в виде GSH в печени [17]. Доступность цистеина, по-видимому, является фактором, ограничивающим скорость синтеза GSH. Значения GSH ниже нормы при большом количестве истощающих заболеваний и после приема определенных лекарств, что часто приводит к плохой выживаемости [18, 19]. Предоставляя SAA, многие из этих изменений можно отменить.В головном мозге, который обычно является наиболее щадящим органом при дефиците питательных веществ, концентрация GSH снижается, чтобы поддерживать адекватный уровень цистеина. Эта потеря GSH нарушает антиоксидантную защиту. Активной формой глутатиона является восстановленная форма GSH, в то время как неактивная форма GSSG должна быть преобразована в GSH. Обычное соотношение GSH: GSSG в тканях составляет около 100: 1. Хрящ, менее важный для выживания, может плохо себя чувствовать в условиях дефицита серы, что объясняет, почему диетические добавки, содержащие серу (хондроитинсульфат, глюкозамина сульфат, МСМ (метилсульфонилметан) и т. Д.) может быть полезным при лечении заболеваний суставов [20]. Ни GSH, ни синтез GAG в этом контексте не исследовались.

Было показано, что даже гидротерапия сероводородной водой, часто сопровождаемая приемом такой воды и рассматриваемая как эмпирический метод лечения различных заболеваний, включает каскад антиоксидантов, связанный с GSH [21, 22]. Взаимосвязь диеты, возраста и других физиологических параметров с концентрацией GSH в крови и тканях хорошо задокументирована [23–26].Поскольку все исследованные диетические добавки, содержащие сульфат, включая МСМ [27], легко метаболизируются до или вскоре после абсорбции до сульфата или низкомолекулярных промежуточных продуктов, они должны быть в состоянии уменьшить потери GSH, связанные с диетическим дефицитом, повышенным использованием из-за болезни или измененная иммунная функция.

Активные формы кислорода (АФК) образуются во время нормальной клеточной активности и могут присутствовать в избытке при некоторых патофизиологических состояниях, таких как воспаление или предперфузионное повреждение.Эти молекулы окисляют различные клеточные компоненты, но особенно чувствительны серосодержащие аминокислотные остатки [28]. Таким образом, изучение фундаментальных аспектов метаболизма серы, таких как регуляция функции клеток путем окисления и восстановления метионина, а также антиоксидантные эффекты серосодержащих аминокислот [29], может помочь выяснить механизм, с помощью которого работают рассматриваемые пищевые добавки.

Глутатион: его защитная роль против окислительного повреждения и повреждения свободными радикалами и его потенциал для усиления иммунной функции

Способ, которым клетки и ткани реагируют на изменения в потреблении SAA, ограничивается характеристиками ключевых ферментов, участвующих в метаболических путях [30].При низких внутриклеточных концентрациях метионина реметилирование продукта метаболизма предпочтительнее транссульфурации, и метионин сохраняется. С увеличением потребления метионина увеличивается путь транссульфурации, который обеспечивает субстрат для синтеза GSH.

Таким образом, в условиях низкого потребления SAA синтез белка будет поддерживаться, а синтез сульфата и GSH будет сокращен. Изменения в доступности GSH могут отрицательно влиять на функцию иммунной системы и механизмов антиоксидантной защиты.

С другой стороны, было показано, что высокое потребление метионина с пищей (5–6 г / день) повышает уровень гомоцистеина в плазме, несмотря на адекватное потребление витаминов группы В [31–33]. Это вызывает некоторую озабоченность, так как никто не хочет активировать иммунную систему за счет усиления прикрепления моноцитов к эндотелиальным клеткам.

Как обсуждалось ранее, на GSH влияет потребление SAA с пищей. В исследовании изотопов на крысах, когда рационы с различным содержанием SAA давались на адекватных уровнях, 7 молекул S были включены в GSH на каждые 10 молекул, включенных в белок [34].При недостаточном уровне потребления соотношение упало до <3:10. Эта реакция на низкое потребление SAA приводит к нарушению антиоксидантной защиты.

Снижение уровней GSH и, как следствие, антиоксидантной защиты может увеличить риск повреждения хозяина посредством активации фактора транскрипции, что приводит к усилению регуляции провоспалительных цитокинов, таких как факторы ядерной транскрипции и белки-активаторы, индуцируемые в свою очередь. такими агентами, как перекись водорода, митогены, бактерии, вирусы, а также ультрафиолетовое и ионизирующее излучение.

Повреждение клеток окислителем вызовет каскад провоспалительных эффектов за счет производства перекисей липидов. Несмотря на то, что некоторые из этих эффектов являются двухфазными по своей природе, поскольку они связаны с уровнями SAA, общепринято считать, что GSH и связанная с ним антиоксидантная активность оказывают иммуностимулирующий эффект путем активации факторов транскрипции, которые тесно связаны с пролиферацией клеток, а также параллельной противовоспалительный эффект, как описано ранее.

Дальнейшие знания об этих метаболических процессах на других уровнях, помимо доступности субстрата, будут необходимы для того, чтобы мы могли с большей точностью модулировать эти процессы на благо всего организма.

Регуляция биосинтеза простагландинов с помощью глутатиона

Простагландины (PG), как очень хорошо известно, играют важную роль во множестве нормальных функций организма, а также в ключевых метаболических этапах, связанных со многими событиями, связанными с воспалением.

PG синтезируются из свободной арахидоновой кислоты с помощью двух изоформ циклооксигеназы (COX, также называемой PGh3-синтетазой). Хотя доступность арахидоновой кислоты как основного метаболического фактора, контролирующего продукцию PG, активно исследуется, очевидно, что другие клеточные кофакторы также могут регулировать биосинтез PG.

PGH-синтетаза имеет две активности: циклооксигеназную активность, которая вводит 5-членное кольцо в PUFA (полиненасыщенную жирную кислоту), и другую, которая вводит эндопероксид и гидропероксид в PUFA. Активность пероксидазы восстанавливает гидропероксид до гидроксильной группы с использованием GSH в качестве источника восстанавливающих эквивалентов.

Наблюдение, что как конститутивные, так и индуцируемые митогеном изоформы простагландин h3 синтетазы заметно зависят от GSH и GSH пероксидазы [35], вызвало значительный интерес в связи с этим процессом.Сайты действия GSH и пероксидазы GSH на рассматриваемый метаболический путь показаны на рисунке 2.

Ферментативное превращение арахидоновой кислоты (AA) в PG и сайты ингибирования GSH и GSH пероксидазой (GSSPx) . (По материалам Marglit et al. [36]).

Исследования Margalit et al [36] предоставили четкие доказательства на мышах, что повышенные уровни GSH ингибируют продукцию PG и, скорее всего, проявляют свои противовоспалительные эффекты в модели, индуцированной кристаллами уратов, посредством этого механизма.Это ослабление синтеза PG in vivo проливает свет на другое потенциальное преимущество, связанное с повышенным потреблением SAA и адекватными уровнями GSH в тканях. С практической точки зрения это повышает вероятность того, что удовлетворительное потребление SAA в сочетании с PUFA может оказаться значительным преимуществом для людей, страдающих различными аномалиями суставов, связанными с воспалением.

Вопрос о том, как в присутствии адекватных предшественников ПНЖК конститутивные и индуцибельные формы простагландин-Н-синтетазы могут быть индуцированы для выработки соответствующих форм простагландина, необходимых для поддержания тканевого гомеостаза, будет зависеть от дальнейшего понимания кофакторов и механизмов обратной связи. вовлеченный.

Пока не будут даны ответы на эти фундаментальные вопросы, лучшее, что мы можем сделать, это продолжать снижать соотношение омега-6 / омега-3 в нашем рационе ПНЖК (которое в настоящее время составляет около 10,0 по сравнению с 12,0 всего несколько лет назад) за счет увеличения потребление рыбы и некоторых растительных масел, что считается идеальным соотношением 2,3 / 1,0 [37].

Метаболические исследования, изучающие взаимосвязь потребления серы с пищей и экскреции неорганического сульфата с мочой

Приветствуется отсутствие доступных данных о взаимосвязи пищевых добавок, таких как хондроитинсульфат и его аналоги, с потреблением серы с пищей и любой возможной взаимосвязи Нам предстоит рассмотреть серию исследований метаболизма / баланса человека, которые будут связывать потребление белков, пищевых добавок, содержащих серу и SAA, с экскрецией сульфатов.

Наши предварительные исследования были представлены в Американском колледже клинического питания, Американском колледже ревматологии (2001) и впоследствии опубликованы [20]. Эти исследования, хотя и ограниченные по объему, предоставляют дополнительные доказательства быстрого превращения серы в пищевых добавках в неорганический сульфат. Удержание серы из SAA или из диетических добавок, вводимых во время приема пищи с низким или предельным уровнем белка, по сравнению с усиленным выведением во время более высокого уровня потребления, дало ценные ключи к разгадке (рис.3). Из наших результатов следует, что минимальные адекватные значения потребления, определенные в условиях VA у пожилых людей Tuttle et al [6], могут быть ближе к точности, чем те, которые в настоящее время принимаются в качестве RDA.

Прием SAA как часть основной диеты (темная полоса) дополняется добавкой 10 ммоль метионина, вводимой в виде однократной дозы утром в день эксперимента. Таким образом, общая высота столбца представляет поступление S в ммоль. В соседнем столбце указано количество свободного сульфата, выделяемого с мочой за 24-часовой период.

Наши исследования проводились на нормальных добровольцах (возраст 35–70). Сульфат, свободный и этерифицированный, определяли модификацией нефелометрического метода Берглунда и Сорбо [38] и креатинина мочи с использованием набора (555-A) от Sigma. Потребление SAA оценивали с помощью программного обеспечения для анализа питания (ESHA Research, версия 7.6). L-метионин (Solgar) покупали в виде пищевых добавок. Состав L-метионина с замедленным высвобождением был специально приготовлен Xcel Medical Pharmacy (Woodland Hills, CA.).

Взаимосвязь между диетическим потреблением белка с метионином или S-содержащими соединениями или без них и экскрецией свободного сульфата с мочой

Субъекты были адаптированы к определенному уровню диетического белка, начав их диету за 24 часа до фактического теста. Уровни протеина были увеличены за счет добавления к основному рациону обезжиренного тунца, который в основном состоит из протеина. На рис. 3 приведены результаты исследований баланса серы, включающих добавки L-метионина.

Наши результаты (рис. 3) ясно демонстрируют, что задержка S происходит во время потребления низких уровней белка.Когда потребляется менее 10 ммоль серы, полученной из пищевых белков, добавление в рацион 10 ммоль L-метионина сопровождалось сохранением этой аминокислоты. При более высоком уровне потребления белка с пищей, когда предположительно удовлетворяются потребности в сере, практически весь метионин, добавленный в рацион, выводится с мочой.

Значительное удержание метионина при низком уровне потребления белка дало первые подсказки о том, что наш рацион серы может быть пограничным или даже неудовлетворительным для многих людей.

Потребление SAA в нормальной популяции: связь с RDA и потенциальной потерей сульфатов, связанной с метаболизмом лекарства

Обобщенную оценку потребления и качества диеты очень сложно сделать по очевидным причинам. Неоднородность населения (культурная, социально-экономическая, этническая, географическая, род занятий, потребление фаст-фуда, реклама и т. Д.) — все это влияет на потребление пищи. Тем не менее, для целей этого исследования казалось важным попытаться создать профиль, который охватывал бы различные сегменты населения и соотносил полученные значения с принятой RDA для SAA и альтернативными более высокими требованиями, предложенными другими.Чтобы получить более подробное представление, мы сгруппировали различных людей, прошедших оценку, в подгруппы (таблица 1).

Несмотря на то, что диеты периодически меняются, мы заметили, что люди склонны придерживаться определенных повторяющихся схем, которые в некотором роде облегчили оценку. Потребление SAA, измеренное у 32 человек, колебалось от 1,8 до 6,0 г / день (от 14 до 45 ммоль / день). Для расчетов цистеин и метионин были объединены как SAA.В целом соотношение цистеин / метионин близко к белку из птицы и красного мяса и 0,7 для рыбы. Молочные продукты, как правило, содержат немного больше метионина, а продукты, богатые крахмалом, немного больше цистеина. Яйца содержат значительно больше цистеина. Для оценки молярных концентраций использовали соотношение 1: 1. Некоторые из более низких значений SAA, зафиксированные в нашем опросе, включали людей, которые, как правило, были более заботливыми о своем здоровье и не потребляли красного мяса и небольшого количества животного белка, а также тех, кто потреблял «модные диеты».Многие пожилые люди могут оказаться полностью дефицитными (группа X) независимо от используемых критериев (рис. 4). Очевидно, что эти диетические оценки следует считать очень предварительными, но в настоящее время они предназначены для того, чтобы попытаться пролить свет на редко исследуемую территорию.

Диетическое потребление SAA (метионин плюс цистеин), измеренное в различных подгруппах населения. Их сравнивали с предложенными требованиями: RDA (1989), 2x RDA (запас прочности Роуза) [4] и Tuttle et al [6], определенными для пожилых людей.Справа от каждой группы находится сплошная полоса, которая представляет потребление SAA, уменьшенное на 0,9 г / день, чтобы учесть предполагаемую потерю серы, связанную с потреблением стандартной дозы ацетаминофена, выводимого в виде сульфатированного конъюгата.

На приведенном выше рисунке сравнивается потребление SAA в г / день с принятой RDA (1989), удвоенными значениями RDA, принятыми для обеспечения большей безопасности большой популяции, и значениями, полученными для пожилых людей в результате исследования VA Tuttle et al. al.[6].

Также включен столбец, в котором доступные SAA уменьшаются на 0,9 г / день, что эквивалентно потере SAA, связанной с приемом стандартной более высокой рекомендованной дозы парацетамола. Как уже отмечалось, этот препарат, как и некоторые другие, выводится в основном конъюгированным с сульфатом. В зависимости от того, какое допущение для минимальных требований используется, только те группы, которые появляются выше границы отсечения, будут получать адекватное количество SAA. Используя оценки Tuttle et al [6] (которые хорошо согласуются с нашими текущими оценками) в сочетании с предполагаемой потерей сульфата из-за конъюгации с ацетаминофеном, большая часть населения, в которую входят наиболее уязвимые к OA, может оказаться с дефицитом серы. или получающих предельное потребление.

В настоящее время мы не можем сделать какие-либо однозначные выводы из этих оценок. Мы знаем, что реабсорбция сульфатов почками увеличивается в периоды дефицита [39], но неизвестно, как долго может сохраняться такой щадящий эффект. Значения, полученные Tuttle et al., Получены из ограниченной выборочной популяции VA. То же самое и у нас, и у Роуза и др. Пока эти исследования не будут расширены за счет одновременного определения S и N-баланса и исследований биосинтеза на животных, а также до проведения хорошо контролируемых исследований S-баланса на людях, мы не сможем четко ответить на этот важный вопрос.

Следует отметить, что мы не смогли найти в зарегистрированной литературе никаких исследований, которые эффективно измеряли бы баланс серы у человека или других животных. В этой связи все метаболические исследования, даже те, которые сосредоточены на потребностях в серных аминокислотах, изучают баланс азота, но не баланс серы. По сути, это означает, что роль серосодержащих аминокислот оценивалась только в синтезе белка, но никогда не с точки зрения их способности вносить серу во многие важные метаболиты.В рамках наших предварительных исследований мы оценили потребление SAA с пищей, экскрецию неорганического сульфата и креатинина с мочой у 35-летнего мужчины, потребляющего произвольно сбалансированную диету в течение 3-дневного периода. Результаты представлены на рис. 5.

Выведение сульфатов и креатинина с мочой во время стандартной диеты в течение 48 часов.

На приведенном выше рисунке подчеркивается еще один аспект предлагаемых исследований — взаимосвязь между выделением S и N.Мы не включали эфирный сульфат (менее 5% от общего количества), поскольку лекарства не принимались. Экскреция креатинина в течение 24-часового периода долгое время была связана с мышечной массой и использовалась для метаболических расчетов. Они бесполезны для исследований N-баланса, так как не отслеживают потребление белка [40]. С другой стороны, очевидно, что потребление и выведение сульфатов довольно хорошо коррелируют. Свободные аминокислоты, как правило, не могут храниться, и, в частности, SH-фрагмент цистеина легко окисляется.Цистеин может быть цитотоксичным, поскольку реакционноспособная тиоламиновая структура может сочетаться с альдегидами, такими как пиридоксаль, а также может хелатировать основные двухвалентные катионы. SAA используются для пополнения запасов GSH, который можно рассматривать как форму хранения серы, и только когда эта цель достигнута, избыток окисляется до сульфата.

Выведение сульфата, связанное с приемом метилпреднизолона, включено, чтобы проиллюстрировать, как катаболическое событие может повлиять на потерю серы (рис. 6). Поскольку стероиды часто используются пациентами с заболеваниями суставов, большая экскреция сульфата может, среди прочего, мешать синтезу PG и других важных метаболитов, таких как GSH.Этот аспект катаболического эффекта стероидов, похоже, не исследован.

Выведение с мочой свободного сульфата после однократного перорального приема метилпреднизолона (24 мг) с последующей второй дозой (20 мг) на следующий день при соблюдении диеты, которая обеспечивала 19 ммоль SAA / день.

Употребление газированной минеральной воды, содержащей 0,5 г сульфата / литр (в данном случае Сан-Пеллегрино, одна из очень немногих минеральных вод, содержащих сульфат-ионы) в течение дня (2 литра, содержащие примерно 10 ммоль), сопровождалось количественным выделением сульфат, когда уровни пищевого белка обеспечивали 25 ммоль SAA или более в день (рис. 7).

Выведение сульфата с мочой за сутки у лиц, потребляющих различное количество белка в сочетании с 10 ммолями сульфата из источника минеральной воды, равномерно распределенных в дневные часы и по сравнению с контролем (случай 1, базальная диета : 17 мМ диетическая SAA, случай 2, базовая диета: 26 мМ SAA).

Эти данные подтверждают наблюдение, иногда оспариваемое, что неорганические сульфаты легко абсорбируются и выводятся с мочой, несмотря на осмотические эффекты, которые они могут вызывать и которые приводят к их использованию в качестве слабительных [11, 41].В нашем случае постоянное введение разбавленного раствора могло способствовать абсорбции из желудочно-кишечного тракта и усилению экскреции с мочой. По оценкам, абсорбция в тонком кишечнике достигает 5 ммоль / день, а оставшаяся часть абсорбируется в толстой кишке [41].

Уровни сульфатов в питьевой воде значительно различаются в зависимости от их источника и местонахождения. Исследование, проведенное в Огайо, по оценке концентраций сульфатов в колодезных водах, потребляемых сельскохозяйственными животными, показало, что значения находятся в диапазоне от 6 до 1600 г / литр.На этикетке указано, что вода San Pellegrino из итальянского источника содержит 0,535 г сульфат-ионов на литр. Мы экспериментально обнаружили, что использованные партии не отличались более чем на 5% от заявленного значения. Неорганические сульфаты — это лишь второстепенные компоненты нашего рациона. Некоторые обработанные или обогащенные продукты содержат незначительное количество сульфитов в качестве консервантов, а некоторые добавки, входящие в состав муки, например (сульфат железа), могут содержать сульфат. Чеснок, лук и брюссельская капуста содержат значительное количество серы.Корма, скармливаемые животным, были исследованы на предмет содержания серы гораздо более подробно, чем продукты для людей, и наблюдались колебания от 0,2% в жоме свеклы до 1,2% в жмыхе канолы (в пересчете на сухой вес). Как отмечалось ранее, уровень серы в рационе может сильно повлиять на рост и здоровье скота.

Потребности пожилых людей в белках и аминокислотах с особым упором на серосодержащие аминокислоты

Расчетные потребности в белках для всех возрастов, как обсуждалось ранее, основывались на исследованиях азотного равновесия и иногда подкреплялись функциональными показателями, такими как иммунитет. функция или мышечная сила.Данные из различных источников свидетельствуют о том, что потребность в белке для азотного равновесия у пожилых людей превышает 0,8 г / кг веса тела в день. Предлагались значения около 1,0 г / кг [42]. Однако из-за методологических трудностей данные не позволяют сделать очень надежный прогноз.

Как указывает Янг [43], наши знания о диетических потребностях пожилых людей часто ограничены и противоречивы, хотя по-прежнему прилагаются значительные усилия для решения этой проблемы.Существует общее мнение, что потребности этой популяции в белках недооцениваются, и было высказано предположение, что в общей сложности 15% потребностей в энергии этой популяции обеспечивается за счет белков. Это соответствует примерно 75–85 г белка в день. Это количество белка обеспечит от 3,5 до 4,0 г SAA в день, что более чем соответствует всем оценкам потребностей в этих аминокислотах. К сожалению, этот уровень потребления белка нечасто достигается пожилым слоем населения.Хорошо известная саркопения, связанная с пожилым возрастом, по-видимому, частично связана со снижением потребления белка и энергии, вызванным изменениями вкусовых ощущений, зубными рядами, социальной изоляцией, депрессией и экономическими факторами. В дополнение к неоптимальному потреблению пищи пожилые люди, по-видимому, заменяют белок пищей, богатой жирами и углеводами, что также может отражать изменения вкуса [44]. Рекомендации ВОЗ по потреблению SAA в дозе 13 мг / кг массы тела находятся в том же диапазоне, что и рекомендации RDA.Существует мнение, что при заболеваниях и после травм эти значения могут быть в 2–3 раза выше [45].

Растет объем данных, указывающих на потенциальную важность окислительного стресса и, как следствие, изменений окислительно-восстановительного состояния при многих заболеваниях, включая сепсис, хроническое воспаление, рак, СПИД / ВИЧ и, конечно же, старение. Эти наблюдения требуют постоянного внимания к потенциальной добавочной роли добавок SAA в форме дополнительного белка или, как было обнаружено, полезного, N-ацетилцистеина в некоторых конкретных обстоятельствах.Из-за токсичности цистеина и, возможно, даже добавок метионина, вводимых в избытке, и внутренних проблем, связанных с индуцированным дисбалансом аминокислот, белки, богатые SAA, рассматривались как добавки. Immunocal ^® , очищенная молочная фракция, обогащенная сывороточным белком, в настоящее время используется из-за ее способности усиливать антиоксидантную защиту и улучшать иммунную функцию [46]. Двадцать граммов / день Immunocal значительно улучшили мышечную активность и уровень GSH лимфоцитов в группе из 20 молодых людей.Хотя сывороточные белки содержат значительно больше цистеина, чем казеина (2,5% против 0,35), общее количество общих SAA отличается менее значимо (5,2% против 3,2%).

Стоимость и доступность стали еще одним ключевым фактором в снижении потребления белка с пищей у пожилых людей, так же как и предполагаемая непереносимость определенных групп продуктов, трудности при разрыве и пережевывании волокнистой пищи, а также страх употребления слишком большого количества жира или холестерина. К сожалению, яйца, аминокислотный профиль которых считается стандартом, с которым сравниваются другие белки, и которые относятся к белкам с более высоким содержанием SAA и являются одними из наименее дорогих с точки зрения стоимости, часто не включаются в качестве основных ингредиентов в диеты пожилых людей.

Нельзя недооценивать важность диетического белка для этой группы населения, поскольку недостаточное потребление белка способствует, среди прочего, снижению резервной емкости легких, повышенной хрупкости кожи, остеопорозу, снижению иммунной функции и мышечной массы (саркопения), плохому заживлению и более длительное восстановление после болезни [2, 47].

6.5: Биохимия серосодержащих аминокислот

S. cerevisiae требует для жизни трех серосодержащих аминокислот.Помимо Met
и Cys, которые включены в клеточные белки, клеткам также требуется S-аденозилметионин (AdoMet), который поставляет активированные метильные группы для многих реакций метилирования. Консенсусное мнение о синтезе этих трех аминокислот на предыдущей странице теперь хорошо подтверждается биохимическими и генетическими данными из многих лабораторий (обзор в Thomas
& Surdin-Kerjan, 1992). Связь ген-фермент не могла быть окончательно установлена ​​до тех пор, пока не были разработаны методы молекулярного клонирования и секвенирования ДНК, которые позволили исследователям использовать плазмидную комплементацию для непосредственного тестирования функции генов.В этих экспериментах исследователи сконструировали плазмиды с генами MET , CYS или SAM дикого типа, которые были трансформированы в мутантные штаммы. Трансформированные штаммы были способны выжить только в том случае, если плазмида содержала аллель дикого типа инактивированного гена в мутанте. (Вы будете использовать плазмидную комплементацию в этом классе, чтобы подтвердить идентификацию ваших штаммов и плазмид.)

Большинство генов, с которыми мы будем работать в этом семестре, кодируют ферменты, которые катализируют взаимное превращение одной серосодержащей молекулы во вторую серосодержащую молекулу.Другие гены MET кодируют ферменты, которые не участвуют напрямую в синтезе серосодержащих аминокислот, но катализируют синтез кофактора или донора метила, необходимого для синтеза серосодержащих аминокислот. В кратком описании ниже мы проследим превращение атома серы из неорганического сульфата в его превращение в Met, Cys или AdoMet.

Ассимиляция сульфатов включает активацию серы и восстановление до сульфида

Ранние этапы пути, который включает реакции, участвующие в превращении сульфата в сульфид, включают путь ассимиляции сульфата.Сульфат-ионы являются источником большинства серы в биологических молекулах, но требуется значительная метаболическая энергия, чтобы активировать сульфат из его степени окисления +6 и преобразовать его в сульфид, который имеет степень окисления -2. Ферменты, ответственные за ассимиляцию сульфатов, широко распространены в микроорганизмах и растениях. В S. cerevisiae сульфат сначала активируется АТФ-сульфурилазой, или Met3p, с образованием 5’-аденилилсульфата (APS). Затем APS фосфорилируется Met14p или киназой APS, образуя 3’-фосфо-5’-аденилилсульфат (PAPS).PAPS представляет собой интересную молекулу, поскольку она содержит активированный атом серы, который можно использовать для различных реакций переноса серы. У млекопитающих PAPS используется для различных реакций сульфатирования в Golgi, где акцепторы включают липиды, белки и множество небольших молекул. (Интересно, что киназа APS — единственный дрожжевой фермент, участвующий в ассимиляции сульфатов с гомологами у млекопитающих.)

Последние две стадии ассимиляции сульфатов — это НАДФН-зависимые реакции восстановления.PAPS-редуктаза, или Met16p, катализирует первую реакцию, которая добавляет два электрона к атому серы. Окончательное 6-электронное восстановление катализируется сульфитредуктазой. Сульфитредуктаза представляет собой сложный металлофермент, содержащий две субъединицы Met5p и две субъединицы Met10p, а также несколько простетических групп, включая сирогем, которые участвуют в переносе электронов. (Простетическая группа — это ион металла или органическая молекула, ковалентно связанная с ферментом и необходимая для его активности.) В дрожжах сирогем синтезируется в серии реакций, катализируемых Met1p и Met8p.Синтез сирогема формально не считается частью пути ассимиляции сульфата, но его функция является критической для сборки функциональной сульфитредуктазы.

Синтез и трансульфурация гомоцистеина

На следующем этапе биосинтеза Met и Cys сульфид включается в аминокислотный гомоцистеин (Hcy). Hcy находится в точке разветвления между несколькими путями в дрожжах. Аминокислотный каркас Hcy в конечном итоге происходит из аспарагиновой кислоты, которая была преобразована в
за серию стадий в гомосерин.(Примечание: «гомо» аминокислоты имеют дополнительный атом углерода в своих боковых цепях по сравнению с однофамильцами без префикса.) Met2p активирует гомосерин
в реакции ацетилирования, в которой используется ацетил-КоА. Met17p, также известный как гомоцистеинсинтаза или O-ацетил гомосеринсульфгидриаза, затем катализирует реакцию O-ацетилгомосерина с сульфидом с образованием Hcy.

В дрожжах Hcy служит предшественником Cys или Met. Путь, соединяющий Hcy и Cys, называется путем транссульфурации.Транссульфурация обеспечивает S. cerevisiae необычайной гибкостью в отношении источников серы. Четыре различных генных продукта участвуют в превращении Hcy в Cys и наоборот, используя цистатионин (см. Ниже) в качестве общего промежуточного продукта. Str2p катализирует синтез цистатионина из Cys и O-ацетилгомосерина, продукта реакции, катализируемой Met2p. В противоположном пути Cys4p (также известный как Str4p) катализирует синтез цистантина из Hcy и Ser. Четыре гена, участвующие в пути переноса серы, демонстрируют разные закономерности эволюционной консервации.Например, E. coli не может синтезировать Cys из Met, в то время как млекопитающие не могут синтезировать Met из Cys.

Цистатионин является промежуточным продуктом для реакций трансульфурации. Ферменты в пути транссульфурации S. cerevisiae кодируются генами STR1 — STR4 . Str2p и Str1p (Cys3p) катализируют синтез и гидролиз, соответственно, связи цистатионина S-C _g . Str3p и Str4p (Cys4p) катализируют соответственно синтез и гидролиз цистатиониновой связи S-C _b .

Метионин и AdoMet образуются во время метильного цикла

Hcy также является отправной точкой цикла, который производит Met и AdoMet. Цикл начинается, когда Met6p катализирует превращение Hcy в Met, используя необычный донор метила, полиглутамил-5-метилтетрагидрофолат (THF). Гены MET13, и MET7 кодируют ферменты, которые катализируют последние две стадии синтеза полиглутамил 5-метил-ТГФ, что объясняет их неспособность клеток met7 и met13 синтезировать метионин.

Как и следовало ожидать, большая часть метионина используется для синтеза белка в клетках, но заметное количество преобразуется в высокоэнергетический донор метила, AdoMet, двумя почти идентичными синтазами AdoMet, Sam1p и Sam2p. S. cerevisiae способен синтезировать большие количества AdoMet, который либо используется для реакций трансметилирования, либо хранится в вакуоли. (Фактически, дрожжи являются источником большинства коммерчески производимых AdoMet.) Множественные дрожжевые метилтранферазы катализируют перенос метильных групп от AdoMet к сотням различных субстратов, которые включают нуклеотидные основания и сахара в ДНК и РНК, различные боковые цепи аминокислот в белки, липиды, небольшие молекулы и многое другое.Каждая реакция трансметилирования генерирует одну молекулу S-аденозилгомоцистеина (AdoHcy), которая гидролизуется Sah2p до аденозина и Hcy, завершая метильный цикл.

Мы не будем изучать ферменты, участвующие в метильном цикле этого класса, но
важно понимать их важность для выживания клеток. Аминокислотные последовательности Sam1p и Sam2p идентичны на 93%, что намного выше, чем у других белков, возникших в результате дупликации генов в S. cerevisiae .Эта избыточность обеспечивает буфер против потери любой функции. Клетки с мутацией в гене SAM1 или SAM2 способны выжить, но клетки с мутациями в обоих генах не могут выжить. Сходным образом ген SAh2 является одним из немногих важных генов в S. cerevisiae , вероятно, потому, что накопление AdoHcy будет ингибировать многие реакции метилтрансферазы.

Мутации нарушают биохимические пути

Мутанты met , которые вы анализируете, не способны катализировать одну из реакций, необходимых для синтеза серной аминокислоты.В этой лаборатории вы будете использовать селективные и дифференциальные среды, чтобы определить, какие гены были инактивированы в ваших штаммах. Думайте о каждой мутации как о стирании одной из стрелок, показанных на пути серно-аминокислотного пути. Наши селективные среды содержат множество источников серы. В зависимости от положения мутации встретился с мутацией относительно источника серы, штамм может или не может быть способен синтезировать серные аминокислоты.

Вы также будете использовать дифференциальную среду, агар BiGGY, чтобы различать штаммы дрожжей
по количеству производимого ими сероводорода.Это связано с тем, что BiGGY содержит висмут, который реагирует с сульфидом с образованием осадка от коричневато-черного до черного. Ожидается, что все штаммы будут расти на BiGGY, поскольку он содержит дрожжевой экстракт, который является источником метионина. BiGGY также содержит сульфит, а не сульфат, в качестве основного источника серы. Найдите положение мутировавших генов в пути относительно сульфида и сульфита. Мутации в генах перед сульфидом должны давать более светлые колонии, так как будет производиться меньше сульфида. Из них мутации, предотвращающие восстановление сульфита, должны давать самые легкие колонии.Мутации в генах ниже сульфида должны приводить к образованию более темных колоний, потому что штаммы не могут метаболизировать сульфид.

Делая свои прогнозы для этого эксперимента, вы можете найти эту аналогию полезной: метаболический путь мало чем отличается от одностороннего ( из-за энергетических соображений, большинство метаболических путей являются однонаправленными ) шоссе с серией мостов, соединяющих острова. ( Острова имеют разные уровни энергии. ) Машины, проезжающие по шоссе, представляют собой молекулы, которые превращаются из одной формы в другую.Когда автомобиль подъезжает к следующему острову на пути, его цвет меняется, потому что он превратился в другую молекулу. Мосты — это ферменты
в пути. Они облегчают проезд автомобилей, поскольку катализируют реакции, в результате которых одна молекула превращается в другую. Если мутация происходит в гене, кодирующем определенный фермент, этот конкретный мостик рушится. Перед разрушенным мостом начинают скапливаться машины, и очень мало машин можно будет найти на островах за разрушенным мостом.В некоторых случаях может быть альтернативный маршрут или путь спасения, но обычно это менее эффективный путь.

Sulfur Biology

Молекулы, содержащие восстанавливающий тиол, такой как глутатион, цистеин и белок, реагирующий на окислительно-восстановительный потенциал, в живом организме действуют как антиоксидантные или реагирующие на окисление молекулы. Эти молекулы считаются наиболее важной группой молекул, которые способствуют поддержанию окислительно-восстановительного гомеостаза в живом организме.Персульфиды и полисуфиды (Рис.1), содержащие сульфаны серы, привлекают большое внимание в поддержании клеточного окислительно-восстановительного гомеостаза.

Список литературы
1) Х. Кимура, редактор, «Сероводород и его терапевтическое применение»
2) Ю. Кимура, Ю. Миками, К. Осуми, М. Цугане, J-I. Ока и Х. Кимура, «Полисульфиды — возможные сигнальные молекулы, производные от h3S, в головном мозге крысы», FASEB. J. , 2013 , 27 , 2451
3) С. Койке, Ю. Огасавара, Н. Сибуя, Х. Кимура и К.Исии, «Полисульфид оказывает защитное действие против цитотоксичности, вызываемой трет-бутилгидропероксидом, посредством передачи сигналов Nrf2 в клетках нейробластомы», FEBS Lett. , 2013 , 3548
4) Т. Ида, Т. Сава, Х. Ихара. Ю. Цучия, Ю. Ватанабэ, Ю. Кумагаи, М. Суэмацу, Х. Мотохаши, С. Фуджи, Т. Мацунага, М. Ямамото, К. Оно, Н. О. Девари-Баез, М. Сиань, Дж. М. Фукуто, и Т. Акаике, «Реактивные персульфиды цистеина и S-политиоляция регулируют окислительный стресс и окислительно-восстановительную передачу сигналов», Proc Natl Acad Sci US A.