Травы иммуностимуляторы: Лекарственные травы для укрепления иммунитета. Фитопрепараты для детского иммунитета

Содержание

Статьи об иммунитете, как поддерживать крепкий иммунитет на протяжении всех сезонов года

Статьи об иммунитете, как поддерживать крепкий иммунитет на протяжении всех сезонов года | Imunele.ru Ослабленный иммунитет: что делать? Наша иммунная система в режиме нон-стоп защищает организм от различных бактерий и вирусов. Но когда иммунитет ослабевает, это отражается на самочувствии человека. Читать подробнее Список продуктов для иммунитета У иммунной системы сложная задача: она должна быть всегда наготове, чтобы вовремя заметить и правильно среагировать на «вторжение» патогенов, идентифицировать «врага».

Для правильного функционирования иммунная система нуждается в сбалансированном питании, которое должно включать полезные для иммунитета продукты. Читать подробнее Укрепление иммунитета Иммунитет не случайно называют «внутренним врачом» , помогающим противостоять болезням. Механизм его действия сложен, но суть проста: когда в организм попадают вредные бактерии или вирусы, иммунная система должна их опознать и нейтрализовать. Читать подробнее Частые простуды: причины и что делать Постоянная простуда – что делать? Это один из самых популярных вопросов, который задают врачам.

Простудой часто называют ОРВИ – острые респираторные вирусные инфекции. Лекарства облегчают симптомы простуды, но главный защитник — внутри нас. Читать подробнее Как быстро восстановиться после болезни и укрепить иммунитет Болезнь ослабляет организм. Причина в том, что он тратит много ресурсов на иммунный ответ. Чтобы восстановить иммунитет после заболевания, организму нужно время. Читать подробнее Как не заболеть в холодную погоду Осень и зима – всегда стресс для организма: происходят резкие перепады температуры, энергозатраты на сохранение тепла возрастают, световой день сильно сокращается.

Иммунитету становиться сложнее противостоять инфекциям в таких условиях, поэтому человеку необходимо с особой внимательностью относиться к своему здоровью в этот период и поддерживать иммунитет. Читать подробнее Как поднять иммунитет ребенку Родители часто задаются вопросом, как поднять иммунитет ребенку. Иммунная система начинает «тренироваться», как только ребенок появляется на свет. Читать подробнее Какие витамины нужны для иммунитета Витамины для иммунитета имеют критическое значение.

Однако сам организм либо вообще их не вырабатывает, либо не производит в нужном количестве. Читать подробнее Укрепление иммунитета народными средствами Народная медицина старше официальной на тысячелетия, однако наука к ней относится осторожно: пока не получено исчерпывающих доказательств, ученые не спешат с выводами. Читать подробнее Ослабленный иммунитет: что делать? Наша иммунная система в режиме нон-стоп защищает организм от различных бактерий и вирусов.

Но когда иммунитет ослабевает, это отражается на самочувствии человека. Читать подробнее Список продуктов для иммунитета У иммунной системы сложная задача: она должна быть всегда наготове, чтобы вовремя заметить и правильно среагировать на «вторжение» патогенов, идентифицировать «врага». Для правильного функционирования иммунная система нуждается в сбалансированном питании, которое должно включать полезные для иммунитета продукты. Читать подробнее Укрепление иммунитета Иммунитет не случайно называют «внутренним врачом» , помогающим противостоять болезням.

Механизм его действия сложен, но суть проста: когда в организм попадают вредные бактерии или вирусы, иммунная система должна их опознать и нейтрализовать. Читать подробнее Частые простуды: причины и что делать Постоянная простуда – что делать? Это один из самых популярных вопросов, который задают врачам. Простудой часто называют ОРВИ – острые респираторные вирусные инфекции. Лекарства облегчают симптомы простуды, но главный защитник — внутри нас. Читать подробнее Как быстро восстановиться после болезни и укрепить иммунитет Болезнь ослабляет организм.

Причина в том, что он тратит много ресурсов на иммунный ответ. Чтобы восстановить иммунитет после заболевания, организму нужно время. Читать подробнее Как не заболеть в холодную погоду Осень и зима – всегда стресс для организма: происходят резкие перепады температуры, энергозатраты на сохранение тепла возрастают, световой день сильно сокращается. Иммунитету становиться сложнее противостоять инфекциям в таких условиях, поэтому человеку необходимо с особой внимательностью относиться к своему здоровью в этот период и поддерживать иммунитет. Читать подробнее Как поднять иммунитет ребенку Родители часто задаются вопросом, как поднять иммунитет ребенку.

Иммунная система начинает «тренироваться», как только ребенок появляется на свет. Читать подробнее Какие витамины нужны для иммунитета Витамины для иммунитета имеют критическое значение. Однако сам организм либо вообще их не вырабатывает, либо не производит в нужном количестве. Читать подробнее Укрепление иммунитета народными средствами Народная медицина старше официальной на тысячелетия, однако наука к ней относится осторожно: пока не получено исчерпывающих доказательств, ученые не спешат с выводами.

Читать подробнее

Статьи об иммунитете, как поддерживать крепкий иммунитет на протяжении всех сезонов года

Читать подробнее

Статьи об иммунитете, как поддерживать крепкий иммунитет на протяжении всех сезонов года

Читать подробнее

Травы-иммуномодуляторы : Включи настроение

Чтоб не смог коронавирус
Сделать из тебя «паштет»,
Травы пей: они помогут
Укрепить иммунитет!

Иммунитет постоянно находится на страже нашего здоровья. Чем мы можем ему помочь, когда свежий воздух, полноценные питание и отдых нам доступны не всегда? Уделим особое внимание натуральным витаминам. Кстати, у таких растений, как облепиха, клюква, брусника, чёрная смородина и малина можно использовать не только ягоды, но и веточки, листья и корешки. Древние арабы для укрепления сил организма употребляли плоды, листья, косточки и даже ствол финиковой пальмы.

Тибетские монахи пили зелёный и ячменный чай, настои ромашки и зверобоя. А на Руси универсальным средством от болезней считался девясил. Для повышения защитных сил также рекомендуются: цветки клевера, боярышника, плоды или корень шиповника, алыча и хвоя сосны. Отличное средство – настойка корней цикория. Необходимо взять 100 грамм корня и залить кагором (0,5 литра), затем поставить в тёмное место на 3 недели, периодически взбалтывать. Полученный эликсир советуют принимать по столовой ложке вечером, запивая молоком.

Для иммунной системы полезны имбирь, лимонник, а также продукты, богатые белком и клетчаткой. Необходимых витаминов много в овощах, фруктах и растительном масле. Такие важные микроэлементы, как цинк и селен находятся в бразильском орехе и кешью. А укрепляющий бета-каротин содержится в моркови, дыне, абрикосах и шпинате.

Отлично укрепляют иммунитет цветки белой акации, топинамбура, яблони и груши, а также трава чабреца, амаранта, зверобоя, корень солодки, лист и корень земляники. Хороший результат даёт следующий рецепт. Заварить одну столовую ложку измельчённого корня ежевики в пол-литровом термосе, настоять ночь. Его можно пить три раза в день по половине стакана за полчаса до еды и четвёртый раз – перед сном. Будьте здоровы без всякой химии!

Растения-иммуностимуляторы помогут избежать гриппа / Полтавщина

Этот способ укрепления органов и тканей организма требует минимальной затраты времени, денег и природных ресурсов

Скоро нагрянет грипп, новый штамм — говорят врачи. Встретить болезнь во всеоружии и не поддаться ей нам помогут растения, укрепляющие иммунитет. Курс с помощью каждого из них проводится циклами по 2 недели ежемесячно. В течение оставшихся двух недель организм усваивает введенные вещества. В следующем месяце применяется другое растение, укрепляющее организм.

В качестве иммуностимуляторов применяются травы, ягоды, плоды, веточки и листья деревьев, различные цветы и кустарники.

Осенью и зимой можно использовать веточки деревьев и кустарников, а также заранее заготовленные травы и ягоды, аптечные сборы и настойки. Ягоды используют как сушеные, так и быстрозамороженные, с веточками и без. Веточки деревьев и кустарников надо собирать раз в неделю (7 веточек длиной 15–30 см) и хранить в холодильнике или в вазе с водой (как цветы). В 2-3-литровую банку с чистой водой комнатной температуры опустить веточку нужного растения (можно порезать ее на кусочки длиной по 2–3 см) и настоять 1 час. Пить эту воду в течение дня по 1 стакану утром и вечером. Ежедневно веточки менять.

Травы, цветы и плоды заваривать и пить как чай. Учтите, что при заваривании крутым кипятком биологически активные вещества растений разрушаются, белки их денатурируются, т. е. искажается нормальная биохимическая структура трав, и они в итоге оказываются менее эффективными. Поэтому лучше растения заливать чистой холодной водой на ночь, а затем процеживать раствор и пить.

Не стоит заваривать лекарственные растения и в термосе, заливая их кипятком на ночь. В этом случае они слишком долго находятся под воздействием высокой температуры, снижая эффективность положительного воздействия. Поэтому сначала нужно немного остудить кипяток и только после этого закрывать термос.

Береза увеличивает жизненные силы: укрепляет сердечно-сосудистую систему, желудочно-кишечный тракт, легкие; способствует обновлению крови; выводит избыток шлаков и токсинов; улучшает функцию суставов, почек, печени. Рекомендуется при аллергических расстройствах, заболеваниях кожных покровов, воздействует на психику, даря ощущение чистоты, радости. Применение: веточку березы длиной 20–30 см залить двумя стаканами холодной воды. Настоять и пить натощак.

Боярышник — поливитаминное общеукрепляющее средство: усиливает сердечно-сосудистую и нервную системы, нормализует ритм сердца, внутрисосудистое давление, улучшает сон и общее состояние, показан при расстройствах функций щитовидной железы. Применение: по 10–15 капель настойки на 0,5 стакана воды. Ягоды и веточки залить водой на ночь. Мороженые ягоды боярышника — по 1 ст. ложке на ночь.

Календула — укрепляет печень, селезенку, пищеварительную и эндокринную системы. Хорошо снимает воспаления, успокаивает нервную и усиливает иммунную систему. Ее рекомендуют при заболеваниях сердца, гипертонии, бессоннице, кожных и аллергическихрасстройствах, желудочно-кишечных язвах. Применение. Чай — 1 чайную ложку цветков заварить 1 стаканом кипятка и выпить через 5 минут маленькими глоточками. Настойку (1 ч. ложку) развести в 1 стакане теплой воды и выпить.

Липа — помогает дыхательной, сердечно-сосудистой, нервной и мочеполовой системам. Показана при головных болях, метеозависимости, неустойчивом внутрисосудистом давлении, психической неуравновешенности, склонности к судорогам. Применение: заваривать ветки с листьями и цветами и пить как чай.

Мята — прекрасно воздействует напсихику, успокаивая ее, способствует улучшению памяти, развивает уверенность в своих силах, укрепляет сердечно-сосудистую и нервную системы, желудочно-кишечный тракт, обладает противовоспалительным, обезболивающим, противосудорожным, желчегонным воздействием. Применение. Чай из мяты:1 ч. ложку травы на 1 стакан кипятка, или 5 капель настойки на 1 стакан воды.

Облепиха обладает хорошим общеукрепляющим и поливитаминным воздействием на организм, способствует регенерации тканей, заживлению ран и язв, укрепляет желудочно-кишечный тракт, кожу, эндокринные железы. Рекомендуется при ревматических изменениях, расстройствах половой сферы. Применение. Употреблять в пищу сушеные или замороженные веточки с ягодами, а также облепиховое варенье и масло.

Рябина — общеукрепляющее поливитаминное средство. Укрепляет сердечнососудистую, кроветворную, пищеварительную системы. Оптимизирует обменные процессы, выводит избыток солей из организма. Показана при почечно-каменной болезни, геморрое, ревматизме. Применение. Ягоды и ветки залить водой, настоять и пить.

Смородина — поливитаминное общеукрепляющее средство, улучшает пищеварение, работу почек, кроветворение, показана при камнях в печени, почках, мочевом пузыре, заболеваниях кожи и суставов, атеросклерозе.

Солодка обладает противовоспалительным, ранозаживляющим, обезболивающим и восстанавливающим силы свойствами. Заваривать как чай.

Цикорий укрепляет организм на фоне успокаивающего эффекта. Усиливает сердечно-сосудистую, кроветворную, пищеварительную и мочеполовую системы. Применяется в виде чая.

Шиповник — укрепляющее поливитаминное средство. Обладает противовоспалительным, кровоостанавливающим и обезболивающим свойствами. Укрепляет печень, эндокринные органы, систему кроветворения, усиливает половую функцию, ускоряет регенерацию тканей и восстановление суставов при артритах и артрозах. Применение:8–10 ягод заварить 1 стаканом кипятка. Настоять 1 час и выпить.

Эвкалипт обладает противовоспалительным и тонизирующим воздействием. Укрепляет дыхательную, сердечно-сосудистую и пищеварительную системы. Очищают кожные покровы и ускоряет регенерацию тканей. Применение:20 капель настойки на 1 стакан воды.

Татьяна ЕРМОЛЕНКО, «Полтавщина»

Как укрепить иммунитет

Иммуностимуляторы, фитотерапия и закаливание. Развеем мифы о трех самых популярных способах укрепить иммунитет 🧐

💊 Иммуностимуляторы и иммуномодуляторы. Есть только один вид препаратов, которые, как доказано, действуют на иммунитет — иммунодепрессанты. Их назначают для подавления иммунитета, например, когда человеку пересадили донорский орган, чтобы организм его не отторгал.

Недобросовестные производители лекарств называют иммуностимуляторами и иммуномодуляторами препараты, которые усиливают иммунитет или приводят его в «норму». Такие лекарства, чаще всего, — пустышка. Препаратов, которые сами могут определить норму не существует, а те, что способны поднять иммунитет, еще исследуются.

Например, «Анаферон» позиционируют как препарат для укрепления иммунитета, чтобы не болеть зимой. Но количество действующего вещества в нем близко к нулю. За пределами СНГ нет исследований, которые подтверждают его эффективность. В Европе и США «Анаферон» не зарегистрирован.

🌿 Фитотерапия: шиповник, ромашка и другие травы. До сих пор нет никаких доказательств того, что фитотерапия укрепляет иммунитет. Например, о бесполезности самого популярного препарата — эхинацеи — можно прочитать на сайте Международной организации по эффективности медицинских технологий «Кокрейн».

Стать здоровее не получится, даже если пить травы долго, зато могут появиться побочные эффекты: аллергическая реакция, бессонница, тошнота, рвота и диарея.

🥶 Закаливание. Ученые не знают наверняка, помогает ли закаливание укрепить иммунитет. Сегодня больше фактов говорит о вреде переохлаждения. Некоторые исследования показывают, что закаленные люди заболевают реже, но ученые признаются — испытуемые склонны скрывать свои недомогания, что искажает результаты наблюдений. Кроме того, продолжительность каждого эпизода болезни у закаленных людей такая же, как и у незакаленных.

Иммунолог — о борьбе иммунитета против коронавируса – Газета.uz

Издание Anhor.uz опубликовало интервью с кандидатом медицинских наук, клиническим иммунологом-инфекционистом Азизой Ходжаевой о том, как защищается организм от коронавируса, нужно ли вмешиваться в этот процесс и какую роль в формировании иммунитета играют карантинные ограничения.

Ввиду важности темы и мнения врача-иммунолога о лечении иммуностимуляторами «Газета.uz» с разрешения редакции Anhor.uz перепечатывает интервью полностью.

— COVID-19 — совершенно новый вид инфекции, и поэтому у нас нет к ней иммунитета?

— Это верно, но лишь отчасти. Важно понимать: информация об инфекции сравнительно свежая. С момента вспышки заболевания в китайском Ухане мы учимся, получаем новые данные, сравниваем со старыми, и поэтому сейчас в головах у очень многих думающих врачей своего рода винегрет. Коронавирусная инфекция COVID-19, конечно, новая. Но это не значит, что коронавирус как инфект (возбудитель инфекции — ред. ) неизвестен нашему организму. Мы в той или иной степени непременно сталкивались с каким-либо из коронавирусов, даже если переносили его под видом ОРВИ-подобного заболевания.

COVID-19 — это быстрая инфекция. Это означает, что у него короткий инкубационный срок, быстрое развитие болезни, высокая контагиозность и сравнительно быстрое течение. К этому типу относятся грипп, ОРВИ, ОРЗ. Вирусы имеют способность быстро мутировать и изменять участки в своём строении, но всегда остаются и те структуры, которые не меняются, и новая коронавирусная инфекция имеет одинаковые с другими коронавирусными инфектами участки. Поэтому утверждать, что это заболевание для нас совершенно новое, было бы неправильно. При этом у COVID-19 есть структуры, с которыми человеческий организм действительно раньше не сталкивался. В силу этого у нас нет антител, и поэтому мы не всегда уверены в том, кто и как будет болеть.

— Как формируется иммунитет к COVID-19?

— Думаю, ответ на этот вопрос появится через год или два. Речь ведь идет не только о формировании быстрого иммунного ответа, при котором иммуноглобулины класса М (IgM) появляются уже на четвертый-пятый день с момента инфицирования и ранние иммуноглобулины класса G (IgG) — якобы на 14-й день.

По законам иммунологии, качественные иммуноглобулины класса G формируются не ранее чем через три месяца, а вовсе не через две недели с момента мнимого выздоровления. Но как долго они будут оставаться в организме — год, два, пять лет — мы еще не знаем. Это покажут научные исследования, которые будут проводиться. Все, чем мы сейчас располагаем, это информация шести месяцев. Для того чтобы сделать резюме отдаленного характера этого мало.

— В интернете много рекомендаций по тому, как укреплять и помогать иммунитету бороться с COVID-19. Стоит ли вмешиваться в этот процесс, на каких этапах и в чем эта помощь должна заключаться?

— Прежде чем ответить на вопрос, расскажу, что такое иммунитет. Это способность организма сопротивляться «чужим»: вирусам, простейшим, бактериям. Изначально иммунитет сформировался как противовес мутирующим клеткам, то есть, по сути, природа снабдила нас противоопухолевой защитой.

По мере эволюции иммунная система училась противостоять всем угрозам, которые встречались биологическим объектам, в том числе человеческому организму. Сейчас мы обладаем мощной защитной системой с внутренними резервами, которые включаются, как только в тело попадает возбудитель.

К примеру, люди часто жалуются на то, что поднялась температура. Это не что иное как работа иммунитета, в которой принимает участие иммунная и нейроэндокринная системы. Мы не видим и не подозреваем, что в организм попал «чужой», но его чувствуют наши клетки. Они моментально начинают метить врага, показывая другим клеткам, кого нужно уничтожить. Повышается температура, вырабатывается особое вещество интерферон, и вирус оказывается в условиях, в которых не выживет.

Мы подходим к ключевому моменту в ответе на вопрос, стоит ли вмешиваться в работу иммунитета, и необходимо объяснить, что существует несколько вариантов иммунного ответа: гиперэргичный, нормаэргичный и гипоэргичный. Человеческий организм реагирует на возбудителя по-разному: излишне (гиперэргично), умеренно (нормаэргично) и слабо (гипоэргично).

У больного с очень повышенной реактогенностью поднимается очень высокая температура. Как правило, мы сразу стараемся ее сбить — нам некомфортно. Однако до определенных показателей (например, до 38 градусов) сбивать температуру нежелательно, чтобы не блокировать нашу естественную борьбу. Желание облегчить себе жизнь мешает иммунитету работать.

К сожалению, есть у нас и другой крен. На мой взгляд, очень неправильный, особенно применительно к COVID-19. У нас почему-то стараются назначать препараты для иммунитета, а это категорически неверная позиция. Объясню, почему. Патогенез (суть — ред.) коронавирусной инфекции COVID-19 — васкулит. Это особое заболевание с аутоиммунным механизмом, которое приводит к воспалению эндотелия сосудов. Представьте, что пациентом может оказаться человек, у которого от природы гиперэргическая реакция, то есть он всегда отвечает на введение в организм «чужого» очень бурно. Наш «чужой» (COVID-19) обладает тропностью (привязанностью — ред.) к тканям верхних и нижних дыхательных путей и эндотелию сосудов. Он прикрепляется к этой ткани, которая выстилает внутреннюю поверхность кровеносных, лимфатических сосудов, сердечных полостей.

Иммунная система, пытаясь избавить тело от вируса, атакует этот эндотелий и приводит к мощному воспалению. Так называемый цитокиновый шторм это по сути своей защитная реакция организма, но способная этот организм погубить. Если эту атаку усилить препаратом, который заставит клетки индуцировать интерферон, то больного можно потерять.

Лечение иммуностимуляторами — это большая проблема, на которую я и мои коллеги в Facebook-группе «Врачи Ташкента» пытаемся обратить внимание. Нельзя давать больным такие препараты, потому что никогда не знаешь, как поведет себя организм. Есть риск попасть на человека, который дает избыточный ответ на попадание в организм вируса. Если этот ответ усилить иммуностимулятором, то можно привести больного к тому самому васкулиту, от которого хотели его спасти. Во всем мире людей не лечат стимуляторами иммунитета, боятся этого делать.

— Можно ли проверить иммунитет на эту реакцию перед началом лечения?

— Во время острого заболевания этого делать не нужно, потому что карта иммунологического обследования покажет активацию иммунных клеток. Это естественный процесс, он обязан быть. Есть и риск неправильной трактовки информации. Поэтому думающие врачи всегда ориентируются на клинику.

Практически 75−80% людей перенесут COVID-19 в бессимптомной, легкой и среднетяжелой форме. А вот у 20−25% пациентов заболевание будет протекать по гиперэргичному сценарию. Необходимо просто наблюдать за человеком, с тем чтобы оказать ему наиболее правильную помощь, с учетом его преморбидного состояния. Преморбидное состояние — это все фоновые заболевания, с которыми человек может жить: сахарный диабет, гипертоническая болезнь и многие другие, протекающие в хронической форме.

— Что такое коллективный иммунитет, и почему многие страны решили выбрать именно эту стратегию борьбы с вирусом?

— Не все страны дают возможность жителям встретиться с инфектом. Такой путь выбрали Швеция и Беларусь. Но так или иначе, встретившись с возбудителем, организм выработает антитела, и примерно 70% населения страны, у которых уже есть антитела, смогут обеспечить относительную защиту для тех, у кого этих антител нет.

Объясню на примере иммунизации детей. Мы вакцинируем детей, чтобы, во-первых, они сами не заболели, а, во-вторых, чтобы не встретились с инфектом те дети, которые не могут быть иммунизированы в силу того, что у них есть, к примеру, первичный иммунодефицит. Коллективный иммунитет и этих неиммунизированных детей тоже спасает.

Делаем вывод: если у человека есть иммунитет, то он не будет инфицирован. Стало быть, не станет переносчиком вируса и не сможет его передавать. Мы же сейчас наблюдаем большое количество людей, у которых нет антител. Они — воспринимающее звено, которое при встрече с носителем коронавирусной инфекции заражается и заболевает. По сути, эту цепочку Минздрав пытается прервать с помощью карантинных мер, а по факту сражается с ветряными мельницами.

— Что происходит в случае введения карантинных ограничений, к которым Узбекистан вернулся после апрельского режима, и есть ли в них смысл?

— Жесткий карантин в апреле сохранил внутреннюю популяцию в Узбекистане малоинфицированной, то есть большая прослойка населения не встретилась с вирусом.

К сожалению, на этот неиммунизированный фон сейчас легла огромная вирусная нагрузка в лице бессимптомных носителей коронавирусной инфекции, в том числе среди тех, кто вернулся из «красных» стран. Понимаю, что людей нельзя было оставлять далеко и в неизвестности, но, к сожалению, мы не были готовы в плане иммунитета противостоять огромному количеству инфицированных.

Другая проблема — это справки с ложноотрицательным результатом, которые выдают носителям вируса. Происходит это в результате неправильного забора биоматериала, когда мазки берут обычной ватной палочкой вместо специального тупфера (стерильного зонда-тампона).

По этим причинам то, что Россия прошла в марте-мае, мы проходим сейчас. До пика еще не дошли. В Узбекистане, с точки зрения инфекционного процесса, идет подъем, каждый день прибавляется количество пациентов. Положительное во всей ситуации то, что все, у кого сейчас выявляется заболевание, создают для остальных иммунизированную подушку. Эти люди уже инфицированы, и у них формируются антитела.

Я как специалист не вижу смысла в возвращении строгого карантина. Считаю, что нужно было оставить умеренные меры, которые у нас и были. Слышала, что ректор ТашИУВ (профессор Хабибулла Акилов, представитель штаба по борьбе с коронавирусом — ред.) сказал о том, что все койки заняты — возможно, усиление карантина связано именно с этим. Мы боимся за пациентов, которых можем не спасти. Ради них вводится карантин, растягивается во времени инфицирование, чтобы обойтись без резких пиков.

— О каких именно пациентах идет речь?

— В зоне риска находятся пациенты, у которых есть преморбидный фон — фоновые заболевания, с которыми люди живут. Это метаболический синдром, сахарный диабет, гипертония, ишемическая болезнь сердца и другие. С ними можно научиться жить, контролируя заболевания таблетками, диетами, образом жизни. К сожалению, эти пациенты уязвимы, и по наблюдениям врачей именно они болеют тяжелее, и смертность у них выше. Кстати, давно известно, что, к примеру, и вирус гриппа прежде всего уносит тех, у кого отягощенный преморбидный фон.

В случае с COVID-19 в начале говорили, что молодые либо не болеют, либо болеют легко. В этом есть некий дуализм. У нас молодые люди тоже, к сожалению, не абсолютно здоровы, и у них уже к 20−25 годам есть какой-то преморбидный фон. Такие пациенты переносят заболевание сложнее.

— Как вы, с позиции инфекциониста, оцениваете сами карантинные меры: ношение масок, перчаток, тоннели с хлором? Насколько они адекватные?

— Я за ношение масок. У части людей заболевание проходит в бессимптомной форме, но они при этом выделяют вирус. И если человек в правильной маске, а не в тряпочке, которую сейчас на носу носят, чтобы не оштрафовали, то у него больше шансов никого не заразить.

Я за то, чтобы люди носили перчатки. Не одну пару, а две. Так как я имею представление об инфекционном процессе, ношу именно так: сначала надеваю перчатки, которые плотно прилегают к рукам, поверх — перчатки посвободнее. Объясню, почему. Когда хожу на улице, так или иначе дотрагиваюсь до всего. То же самое делают бессимптомные носители. Вероятность подцепить вирус, прикоснувшись к ручке двери, есть всегда. При этом не везде есть возможность обработать руки антисептиком. Поэтому ни в коем случае не касаюсь лица. Когда возвращаюсь домой, наношу антисептик на верхнюю пару перчаток, смываю. Потом иду в ванную, снимаю их, мою руки и только потом снимаю вторую пару. Считайте это профессиональной деформацией.

Распыление хлорки — метод борьбы из области фантастики, но в то же время это хоть какая-то профилактика других микробов. У меня есть тема-триггер, к которой я периодически возвращаюсь в социальных сетях. У нас огромное количество людей, которые плюются прямо на асфальт. Вместе со слюной выделяется множество микробов. Вот тут хлорка очень уместна — она хорошо обеззараживает дороги, бордюры и прочие плоскости.

Главное — я за умеренность. Дело не в том, маска или перчатки — это плохо. Неправильное ношение — вот что по-настоящему плохо. Неадекватные меры — это плохо. Если человек идет по улице в пять утра и рядом с ним никого нет, кроме собаки, которую выгуливает, не нужно надевать маску. Это нормально — не носить маску, если рядом никого нет. В том случае, если рядом толпа, маску лучше надеть. Ещё лучше, когда у каждого на носу маска — риск инфицирования снижается.

То же самое с хлоркой — неправильно опрыскивать людей при входе на базар, в банк. Ей можно чистить асфальт, прилавки. Человеку для защиты достаточно быть в маске и перчатках. Есть и другие, альтернативные меры, которые я хотела бы озвучить. В крупных учреждениях, типа банков, супермаркетов, вместо дезинфицирующих тоннелей можно установить особое оборудование — рециркуляторы, которые в течение дня обеззараживают воздух и безвредны для людей. Этим следовало бы озаботиться.

— Лечение COVID-19 — такая же спорная тема, как карантин. Вы рассказали о вреде иммуностимуляторов, однако в некоторых странах, включая нашу, их продолжают выписывать. Например, «Плаквинил», который тяжело найти в аптеках. Много споров вокруг «Дексаметазона». Почему это происходит?

— Потому что нет прямого противовирусного препарата против данного вируса. В мире врачи стараются пользоваться препаратами, которые являются ингибиторами РНК-содержащих вирусов, то есть способны воздействовать на инфект напрямую. Лечение препаратами, которые воздействуют на вирус опосредованно, стимулируя человеческий иммунитет, — это всегда риск.

Тема лечения для меня очень важна, поскольку я — клинический иммунолог, который занимается вопросами иммунологии инфекционных процессов. В самом начале пандемии ко мне в руки попал китайский справочник. Его срочно перевели, и я была удивлена тому, что там везде фигурировал «Плаквинил». Я знала, что его применяют не только при малярии, но и ревматологи прописывают пациентам для того, чтобы подавлять иммунный ответ. Этот препарат является иммуносупрессором. Он подавляет иммунитет. Дать его человеку с гиперэргической реакцией организма значит не дать ему умереть. Но и в этом существует дуализм: с одной стороны, человек остался жив, с другой — вмешательство не позволило организму сформировать адекватные антитела, и через какое-то время он опять будет уязвим. Поэтому со временем от этого препарата стали отказываться. В медицине это называется «не показал своей эффективности».

«Дексаметазон» — это другая история. Он является системным кортикостероидным гормоном. С 60-х годов его применяли при аутоиммунных ревматоидных процессах. У кортикостероидных гормонов очень широкий план показателей: противоаллергический, противоотечный (что важно при COVID-19), противовоспалительный. По сравнению с иммуноподавляющим «Плаквинилом», который относится к категории С препараторов (очень слабых), «Дексаметазон» оказался более успешным.

Другое отличие — длительность иммуносупрессии, то есть подавления иммунного ответа. У «Плаквинила» она длительная, поэтому его ревматологи прописывали хроникам. У «Дексаметазона» короткая. Его делают раз в сутки. По истечении этого времени гормона уже может и не быть в теле — легко вводится и выводится. При этом успешно снять гиперэргическую реакцию с отеком легких он тоже может. Поэтому иногда не нужно придумывать велосипед, а стоит просто вспомнить, что делали наши предшественники.

В медицине всегда работаешь по факту. Важный момент: официальных диагнозов значительно меньше, чем патологических процессов, которые реализуются в теле человека. Врач смотрит на организм, анализы, и понимает, как он реагирует. Действует, исходя из клиники: не хватает белка — восполняет и так далее.

Процесс познания новой коронавирусной инфекции идет все эти месяцы. Все время возникают временные протоколы. Временные, потому что как только врачи видят, что схема недостаточно успешна, они ее меняют. Одни препараты, как «Плаквинил», «Кагоцел», выводятся, а другие включают. Эти протоколы периодически обновляются за счет новых знаний.

Я видела временное клиническое руководство по ведению пациентов с легкой формой COVID-19 на дому. Конечно, оно должно было появиться на два месяца раньше. Могу сказать, что это хорошее пособие, но, повторюсь, временное — по истечении определенного срока рекомендации, которые там приводятся, перестанут быть актуальными. Появятся новые данные. Нашей системе здравоохранения важно следить за этим процессом, анализировать информацию, а не упорствовать в рамках ложного «сценария». Даже если для его реализации два-три месяца назад закупили препараты. Протоколы пересматриваются, и многих лекарственных средств там уже нет, поскольку исследования показали, что они неуместны и даже вредны.

— Правда ли, что после перенесенного COVID-19 возможны сбои в работе иммунитета?

— Сбои в работе иммунной системы наблюдаются у многих пациентов, которые перенесли какое-либо заболевание. COVID-19 в этом плане не исключение. Известный факт, что после перенесенной кори, краснухи, ветрянки, вирусных заболеваний возникает так называемый «иммунный хвост». Он может длится от трех до шести месяцев. Это закономерно. Когда человек болел, иммунитет приложил все усилия, чтобы спасти своего хозяина. Так как он работал на усиление, ему нужно время, чтобы восстановиться.

— В качестве профилактики новой коронавирусной инфекции рекомендуется принимать витамины. Например, С и D — в ударных дозах. Насколько это безопасно? Нужно ли пить витамин D жителям нашей страны, которые буквально живут под солнцем?

— Пить витамины в профилактических дозах гораздо безопаснее, чем принимать индукторы интерферона и иммуностимуляторы.

Витамин С (аскорбиновая кислота) укрепляет стенки сосудов и считается антиоксидантом. Чтобы уберечь клетки от преждевременной гибели, назначают витамин С как антиоксидант. Я не сторонница ударных доз, потому что витамин С иногда усугубляет мочекислый диатез и другие состояния. А в обычных дозах — почему нет?

Витамин D вырабатывается в организме под воздействием ультрафиолетового спектра излучения. Но дело в том, что часов в 9−10 утра это самое излучение уже заканчивается и начинается инфракрасное, под которым мы все живем. Оно очень вредное. Во-вторых, ультрафиолет не сможет одолеть препятствие в виде нашей одежды. Как показывает статистика, у большинства людей есть дефицит витамина D, поэтому его надо принимать извне. Учитывая, что у него есть токсические дозы, уровень лучше мониторить. Можно сдать анализы и определить необходимую дозу. У людей с нормальным уровнем витамина D в организме заболевание проходит значительно легче.

Цинк и селен — микроэлементы, которые очень хорошо работают с иммунным статусом. Причем не с гипо- и не с гипер-, а именно с нормоэргирующими свойствами, поэтому это самые безобидные рекомендации, которые можно было бы дать. Цинк и селен, к сожалению, в лабораториях не определяют, но их считают пищевыми добавками. Это то, что помогает и не вредит. Цинк пить длительное время не нужно — максимум месяц, потом перерыв. Селен содержится в чесноке — можно есть его (но много чеснока не съешь, поэтому как вариант — принимать препараты с содержанием селена и цинка).

Важно пить побольше жидкости. Мы наполнены жидкостью, это форма существования наших клеток. Если мы не употребляем воду, то наши клетки фактическим образом погибают. Когда человек инфицируется, вирус попадает в носоглотку и какое-то время там сидит, чтобы набрать силу и броситься вниз. Употребляя жидкость, инфект механически смывается туда, где он не выживет, а именно в кислую среду желудка.

Самое важное правило — перестать себя накручивать и ни в коем случае не заниматься самолечением по рекомендациям в интернете. В них встречаются препараты, которые просто небезопасны. Оценить состояние человека и назначить адекватное лечение может только врач.

— Прокомментируйте, пожалуйста, интернет-советы про пользу «лимонада» из лимона и бикарбоната, а также сна на животе.

— Лимон и сода с точки зрения защиты от вируса просто бесполезны. Навредить этим «лимонадом» можно только тем, у кого и так субатрофический гастрит и не вырабатывается соляная кислота. Выпьют соды и подавят даже то, что есть. А соляная кислота у нас очень хороший защитник желудочно-кишечного тракта от других микробов, не только от коронавирусов. Гораздо лучше есть продукты, которые ощелачивают.

Что касается сна, то спать надо так, как удобно. То, что применимо к пациенту с COVID-19, не подходит здоровому человеку. Больных с симптомами коронавирусной инфекции врачи действительно кладут на живот. Это так называемое парадоксальное дыхание, при котором улучшается состояние пациента. Живот при этом находится на пике, под углом 45 градусов, голова и ноги располагаются ниже. Это правильная позиция для стационаров, но не в быту.

— Стоит ли сейчас покупать пульсоксиметры (приборы для измерения уровня кислорода в крови —

ред.)? Сложно ли будет пользоваться ими в быту?

— Пульсоксиметр не очень сложный в использовании, и я считаю, что имеет смысл иметь его дома. При необходимости он может помочь.

Многие звонят мне и спрашивают: «Что делать?» Один из главных моментов — это правильно измерять сатурацию (уровень кислорода в крови). Бывают случаи, когда ПЦР-тест не показывает инфект при наличии клиники COVID-19 (таких симптомов, как отсутствие обоняния, вкуса или наличие странного вкуса в полости рта, сильная слабость, ломота в костях и мышцах, клиника ОРВИ). Плохая сатурация внешне никак не проявляется — человек может что-то делать, например, сидеть и разговаривать. Поэтому нужно просто за ней следить и фиксировать показатели, независимо от признаков.

4 травы, которые естественным образом могут помочь укрепить вашу иммунную систему

Травы, которые могут принести пользу иммунной системе, включают эхинацею, чеснок, женьшень и грибы рейши.
Женьшень может помочь вашей иммунной системе, регулируя иммунные клетки, такие как Т-клетки, которые могут помочь вашему организму отражать угрозы.
Употребление чеснока также полезно для иммунной системы, поскольку он содержит аллицин — соединение, обладающее антибактериальными свойствами.
Эта статья была отрецензирована Джейсоном Р.Макнайт, доктор медицины, магистр медицины, врач семейной медицины и доцент Техасского медицинского колледжа A&M.
Посетите справочную библиотеку Insider Health Reference, чтобы получить дополнительные советы.

Вне зависимости от того, столкнулись ли вы с сезоном простуды и гриппа или просто пытаетесь сохранить здоровье в целом, крайне важно поддерживать устойчивость нашей иммунной системы. Иммунная система отвечает за предотвращение инфекций и борьбу с ними, а когда ваша иммунная система сильна, у вас больше шансов предотвратить болезни.

Важно отметить, что вы не сможете полагаться только на травы для борьбы с болезнью. Чтобы иметь сильную иммунную систему, вам необходимо получать определенные витамины, правильно питаться, хорошо спать и заниматься спортом. И, конечно же, лучший способ снизить риск заболевания — это часто мыть руки и избегать контактов с людьми, которые могут быть больны.

Но помимо этих рекомендуемых практик, некоторые травы могут иметь дополнительные иммунные преимущества. Вот четыре травы, рекомендованные экспертами, чтобы помочь вам укрепить вашу иммунную систему.

Как травы могут принести пользу иммунной системе

Многие травы антагонистичны патогенам, что означает, что они активно борются с такими микроорганизмами, как вирусы, бактерии, черви и насекомые, — говорит Марк Фрост, MSTCM, L.Ac., заведующий кафедрой фитотерапии в Американском колледже. традиционной китайской медицины.

И не только специалисты в области традиционной китайской медицины утверждают, что травы обладают иммуностимулирующими свойствами. Те, кто практикует западную медицину, также выступают за добавление трав в здоровую диету.

Дебора Энн Баллард, доктор медицины, магистр медицины, терапевт в Duke Integrative Medicine, говорит, что она рекомендует использовать в кулинарии различные травы и специи, чтобы стимулировать их потребление.

«Регулярное включение их в здоровую диету имеет очень низкий риск вреда и разумный шанс помочь нашей иммунной системе бороться с инфекциями», — говорит Баллард.

1. Эхинацея

Эхинацея — это растение, которое имеет множество применений.Согласно больнице Mount Sinai, он обладает свойствами, которые могут облегчить боль и уменьшить воспаление, а также обладают противовирусным и антиоксидантным действием. Это делает его идеальной травой для поддержки вашей иммунной системы и усиления ее функций.

Систематический обзор 2006 года, опубликованный в Кокрановской библиотеке, показал, что прием эхинацеи после таких симптомов простуды, как насморк и заложенность носа, может помочь сократить как продолжительность болезни, так и тяжесть простуды. Однако исследователи заявили, что результаты не были последовательными во всех проанализированных ими исследованиях.

Кроме того, в систематическом обзоре 2020 года, опубликованном в журнале «Достижения интегративной медицины», было установлено, что эхинацея может быть полезной при острых респираторных инфекциях, если принимать траву при появлении симптомов. Это связано с тем, что он может снизить уровень провоспалительных цитокинов, связанных с воспалением и респираторными инфекциями.

Фрост говорит, что если вы чувствуете, что подверглись воздействию множества людей и потенциальных микробов, или чувствуете, что можете заболеть, попробуйте принимать эхинацею два или три дня подряд.Следуйте инструкциям по дозировке на упаковке продукта с эхинацеей, который вы употребляете, или проконсультируйтесь с травником. Можно добавить в чай или использовать в качестве настойки.

2. Чеснок

Чеснок — сильнодействующее противомикробное растение, особенно для кишечника, — говорит Фрост. Фактически, он считается антибактериальным, противовирусным и противопротозойным (то есть может бороться с паразитами). Баллард говорит, что эти свойства могут помочь бороться с инфекциями легких и респираторными инфекциями.

Чеснок содержит аллицин, и считается, что это соединение, которое делает чеснок антибактериальным. Согласно обзору 2014 года, опубликованному в Avicenna Journal of Phytomedicine, это позволяет чесноку бороться с такими бактериями, как сальмонелла и кишечная палочка, которые вызывают пищевое отравление.

Кроме того, по словам Фроста, чеснок идеален для укрепления пищеварительной системы. Это делает его хорошим выбором для лечения паразитов или глистов в кишечнике. Обзор журнала Avicenna Journal of Phytomedicine также ссылается на исследование, в котором чеснок использовался для лечения лямблиоза — инфекции, вызванной паразитом.Симптомы пациентов исчезли через 24 часа после приема чеснока либо через жидкий экстракт 1 мг / мл два раза в день, либо через капсулу с чесноком 0,6 мг / мл.

Кроме того, было обнаружено, что чеснок помогает бороться с простуда с его противовирусными свойствами. В обзоре 2014 года, опубликованном в Кокрановской библиотеке, обсуждалось одно исследование, в котором участникам давали чесночные добавки с 180 мг аллицина ежедневно в течение 12 недель или плацебо.Исследователи обнаружили, что те, кто получал чеснок, реже болели простудой, а если они и заболевали, то болели меньше дней, чем те, кто принимал плацебо. Однако необходимы дополнительные исследования.

3. Женьшень

Согласно одному исследованию, эта трава укрепляет ось HPA — гипоталамическую, гипофизарную и надпочечниковую — которая отвечает за регулирование реакции иммунной системы на стресс.

Хронический или тяжелый стресс может ослабить иммунную систему, поэтому важно, чтобы у вас была сильная ось HPA, которая поможет справиться с влиянием стресса на вашу иммунную систему.По словам Фроста, укрепляя ось HPA, вы укрепляете иммунную систему.

Женьшень также может поддерживать баланс иммунной системы, регулируя различные типы иммунных клеток, включая Т-клетки, В-клетки, естественные клетки-киллеры и макрофаги, которые выявляют угрозы для организма и борются с ними. Есть даже доказательства того, что женьшень может бороться с гриппом А у мышей, хотя необходимы исследования на людях.

Фрост говорит, что женьшень очень сильный, и если вы планируете включить его в свой режим, вам следует проконсультироваться с травником.Вы можете потреблять женьшень, заварив чай со свежим корнем женьшеня, или принимать капсулы с женьшенем.

4. Рейши

Рейши, также известный как Линчжи, представляет собой разновидность грибов. Грибы рейши содержат бета-глюканы, которые, как считается, стимулируют различные типы клеток иммунной системы, включая моноциты, естественные клетки-киллеры и дендритные клетки. Стимулируя эти клетки, они лучше обнаруживают инфекции и борются с ними.

По данным Мемориального онкологического центра им. Слоуна Кеттеринга, есть даже некоторые доказательства того, что бета-глюканы в рейши могут оказывать противоопухолевое действие, останавливая рост раковых клеток. Однако необходимо провести дополнительные исследования, чтобы лучше понять преимущества грибов резихи.

Вы можете купить порошок рейши или капсулы для употребления.

Итог

Перед тем, как начать принимать какие-либо из этих трав, вам следует проконсультироваться со своим врачом, чтобы убедиться, что они не будут отрицательно взаимодействовать с любыми лекарствами, которые вы принимаете.Вы также должны убедиться, что вам поставили точный диагноз, если вы заболели — стоит посетить врача, чтобы узнать, какие методы лечения они рекомендуют, прежде чем пробовать травяные средства.

Если вы хотите попробовать эти травы, поговорите с квалифицированным травником или практиком традиционной китайской медицины, чтобы выяснить, какие травы могут вам помочь, а также как лучше всего их принимать. Они также могут помочь вам определить, где купить травы, чтобы убедиться, что вы используете качественные продукты.

Сравнение иммуностимулирующего действия лекарственных трав эхинацеи, ашваганды и брахми

Цель исследования: Травы, как еда или лекарство, могут укрепить организм и повысить его сопротивляемость болезням, воздействуя на различные компоненты иммунной системы. Например, эхинацея известна своей способностью усиливать иммунную функцию, прежде всего за счет активации врожденных иммунных ответов.Здесь мы исследовали способность двух трав, обычно встречающихся в Индии, ашваганды (Withania somnifera) и брахми (Bacopa monnieri), усиливать иммунную функцию, и сравнили их действие с действием эхинацеи.

Материалы и методы: Крыс Sprague Dawley кормили рационом с добавлением 1% (мас. / Мас.) Эхинацеи, ашваганды или брахми в течение 4 недель, чтобы изучить их влияние на иммунную функцию.

Полученные результаты: Диета Брахми стимулировала большую секрецию IgA и IgG в сыворотке по сравнению с эхинацеей или ашвагандой. Независимо от того, присутствовал ли лектин в пище, производство IgA, IgG и IgM в лимфоцитах селезенки увеличивалось с помощью травяных добавок. Концентрации IFN-γ и IL-2, обработанные LPS и ConA, были значительно выше в диетической траве, чем в контроле.Напротив, продукция TNF-α у крыс, получавших диетические травяные добавки, была значительно ниже по сравнению с контрольными животными.

Заключение: Травяные средства на основе эхинацеи, брахми или ашваганды могут усилить иммунную функцию за счет увеличения выработки иммуноглобулинов. Кроме того, эти растительные лекарственные средства могут регулировать выработку антител, увеличивая выработку цитокинов Th2 и Th3.

Использование лекарственных растений в качестве иммуностимуляторов в аквакультуре: обзор

https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2015.03.014 Получить права и содержание

Основные моменты

•: Источники лекарственных растений
•: Химикаты, используемые для извлечения соединений
•: Способы нанесения
•: Механизмы / способ действия
•: Предложения для дальнейших исследований

Реферат

Лекарственные растения известны как иммуностимуляторы на протяжении тысячелетий.Применение лекарственных растений в качестве натуральных и безвредных соединений имеет потенциал в аквакультуре в качестве альтернативы антибиотикам и иммунопрофилактикам. Растущий интерес к этим растениям возрос во всем мире, потому что они просты в приготовлении, дешевы и имеют мало побочных эффектов для животных и окружающей среды. На различных водных животных был изучен широкий спектр лекарственных растений, таких как травы, специи, морские водоросли, лекарственные травы, экстракты трав, традиционные китайские лекарства и коммерческие продукты растительного происхождения.Все растение или его части, а именно. можно использовать корни, листья, семена, цветы или экстракты. Процесс экстракции прост, обычно используются этанол и метанол. Различные химические вещества, используемые для извлечения соединений, могут оказывать различное воздействие на водных животных. Способы применения могут быть как одиночными, так и в комбинации, или даже в смеси с другими иммуностимуляторами, с использованием воды или кормовых добавок и обогащения, где однократное введение так же практично, как и комбинации.Дозировки и продолжительность варьируются, и оптимальные уровни не рассматривались. Лекарственные растения проявляют свои основные свойства в качестве стимуляторов роста, иммунных усилителей, где они действуют как антибактериальные и противовирусные агенты для иммунной системы хозяина. К сожалению, механизмы до конца не изучены. Поэтому большинство авторов не рекомендовали напрямую использовать свои результаты, а предлагались предложения для дальнейших исследований.

Ключевые слова

Лекарственное растение

Травы

Симбиотик

Антибиотик

Иммуностимуляторы

Рекомендуемые статьиЦитирующие статьи (0)

Полный текст

Цитирующие статьи

(PDF) Применение иммуностимуляторов на растительной основе в аквакультуре: обзор􀀁

Краткий курс, спонсируемый ICAR Заметки к лекциям март 2017 г.

Молекулярная иммунология рыб и моллюсков % $ (

исследует новые хемотипы и фармакофоры многих лекарственных растений, но

все еще остаются скудными 5% от общего количества растений, известных человечеству, в то время как потенциал морских

и водных растений практически не используется.Было выполнено очень мало работы по биологической активности

и возможному лекарственному применению растений в борьбе с многочисленными болезнями

, с которыми сталкивается отрасль аквакультуры. Поскольку глобальный сценарий в настоящее время меняется в сторону использования

нетоксичных растительных продуктов, разработка современных фитохимических веществ и лекарств из

лекарственных растений является необходимостью времени для борьбы с различными проблемами болезней рыб. Следовательно, необходимы более

серьезных исследований, чтобы использовать терапевтические свойства лекарственных растений для решения

проблем борьбы с болезнями в аквакультуре.Больше внимания следует уделять исследованиям

по составам трав и разработке лекарств. Рыболовное братство должно многому научиться из

работы, проводимой в области фитотерапии болезней человека и других животных, и применять подходящие принципы

в борьбе с болезнями рыболовного мира.

Кроме того, применение растительных продуктов в качестве иммуностимуляторов показало, что они

увеличивают иммунные ответы, выживаемость и скорость роста рыб.Благодаря положительному эффекту

растительного материала в качестве иммуностимуляторов, его можно использовать в аквафарме в качестве альтернативы вакцинам

, антибиотикам и химическим препаратам. Для улучшения роста и борьбы с болезнями

в аквакультуре внимание должно быть сосредоточено на многих лекарственных травах и лекарствах, полученных из лекарственных растений

, которые можно легко использовать в качестве кормовых добавок. В будущем очистка

и экспериментальная оценка активных соединений из травяных растений

необходимы для эффективного контроля болезнетворных агентов в аквакультуре.

Избранные ссылки

Раман Р.П. (2017) Применимость, осуществимость и эффективность фитотерапии у водных животных

Управление здоровьем. Американский журнал наук о растениях, 8, 257-287.

http://dx.doi.org/10.4236/ajps.2017.82019.

Wada, T., Arima, T., Nagashima, H. (1987) Активность естественных киллеров у пациентов с хроническим гепатитом

, получавших OK432, интерферон, аденинарабинозид и глицирризин.

Gastroenterol Jpn.22 (3): 312–321.

Edahiro, T., Hamoguchi, M. и Kusuda, R. (1990) Эффект глицирризина против

стрептококковой инфекции молодых желтохвостов, Seriola quinqueradiata. Suisanoshiku, 38: 239-

243.

Edahiro, T., Hamoguchi, M., and Kusuda, R. (1991) Подавляющее действие глицирризина против стрептококковой инфекции

, вызванное скармливанием окисленных липидов желтохвосту, сериоле

quinqueradiata, Suisanoshoku, 39: 21-27.

Янг, С.I., Марсден, М.Дж., Ким, Ю.Г., Чой, М.С., и Секомбс, С.Дж. (1995) Влияние глицирризина

на радужную форель, Oncorhynchus mykiss (Walbaum), лейкоцитарные реакции. J.

Рыба. Дис., 18: 307-315.

Рамси, Г.Л., Сивицки, А.К., Андерсон, Д.П. и Bowser, P.R. (1994) Влияние белка соевых бобов

на серологический ответ, неспецифические защитные механизмы, рост и использование белка

у радужной форели. Вет. Иммунол. Immunopathol., 41: 323-339.

Грейсон, Т.Х., Уильямс, Р.Р., Рэтмелл, А.Б., Манн, К. J. Fish. Биол., 31: 195-202.

Ниномия, М., Хатта, Х., Фуджики, М., Ким, М., Ямамото, Т., и Кусуда, Р. (1995)

Повышение хемотаксической активности лейкоцитов желтохвоста (Seriola quinqueradiata) на

Оральный сапонин quillaja.Fish Shellfish Immunol., 5: 325-328.

Артикул | Ответ рыб на иммуностимулирующие диеты

Цитирование

Валлехос-Видал Э, Рейес-Лопес Ф, Телес М. и Маккензи С. (2016) Реакция рыб на иммуностимулирующие диеты. Иммунология рыб и моллюсков , 56, стр. 34-69. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2016.06.028

Реферат
Для поддержания здоровья рыб и повышения продуктивности иммуностимуляторы использовались в качестве диетических добавок для повышения прибавки в весе, эффективности корма и / или устойчивости к болезням у культивируемых рыб.В аквакультуре широко используются неспецифические иммуностимуляторы, вероятно, из-за ограниченных знаний об иммунном ответе у рыб и простоты их применения. Было проведено множество исследований для оценки влияния пищевых иммуностимуляторов на рыбу, в том числе производных водорослей, кормов, содержащих травы и экстракты растений, с использованием широкого спектра последующих аналитических методов. Многие иммуностимуляторы основаны на традициях и фольклоре, передаваемых из поколения в поколение и специфичных для определенных географических регионов, а не на известных биологических свойствах.Однако есть исследования, в которых можно наблюдать четкое и прямое дозозависимое стимулирующее действие на иммунную систему. Другие используемые пищевые добавки содержат PAMP (патоген-ассоциированные молекулярные структуры) в качестве иммуностимуляторов, распознавание которых зависит от взаимодействий PRR (рецептор распознавания патогена), включая TLR (Toll-подобный рецептор). Несмотря на растущий интерес к использованию иммуностимуляторов в аквакультуре, основные механизмы распознавания лигандов, состав экстракта и активация иммунного ответа рыб остаются фрагментированными.В этом обзоре мы сосредоточены на последних 15 лет исследований, посвященных оценке: (1) экстрактов растений, трав и водорослей; и (2) PAMP при неспецифических иммунных параметрах активации и эффективности иммуностимулирующей диеты.

Ключевые слова
Иммуностимуляторы для рыб, иммунный ответ; Водоросли; Травы; Экстракты растений; PAMPs

Journal
Иммунология рыб и моллюсков: Том 56

Статус	Опубликован
Дата публикации	30.09.2016
Дата публикации онлайн	04.07.2019
Дата принятия журналом	21.06.2016
URL	http: // hdl.handle.net/1893/24424
Publisher	Elsevier
ISSN	1050-4648

Регулирование экспрессии воспалительных генов в PBMC с помощью иммуностимулирующих препаратов

Abstract

Многие сотни растений используются в дополнительной и альтернативной медицине для терапевтического использования в качестве противомикробных препаратов и иммуностимуляторов. Несмотря на то, что существует многовековые анекдотические свидетельства и мало клинических исследований активности и эффективности этих растений, существует ограниченное количество научных данных о способности этих растений модулировать иммунные и воспалительные реакции.Это исследование, основанное на ботанике (или гербогеномике), позволяет по-новому взглянуть на воспалительные гены, которые индуцируются в мононуклеарных клетках периферической крови после лечения иммуномодулирующими растительными экстрактами. Эти результаты могут указывать на предполагаемые гены, участвующие в физиологических реакциях, которые, как считается, возникают после введения этих растительных экстрактов. Используя экстракты из иммуностимулирующих трав ( Astragalusmbranaceus, Sambucus cerulea , Andrographis paniculata), и иммунодепрессивное растение ( Urtica dioica), представленные данные подтверждают предыдущие исследования цитокинов этих трав, а также выявление дополнительных генов. в активации и миграции иммунных клеток и различных воспалительных реакциях, включая заживление ран, ангиогенез и модуляцию артериального давления.Кроме того, мы сообщаем о наличии липополисахарида в приготовленных в медицинских целях экстрактах этих трав, который, как предполагается, является естественным и активным компонентом иммуностимулирующих травяных экстрактов. Представленные данные дают более обширную картину того, как эти травы могут опосредовать свое биологическое действие на иммунные и воспалительные реакции.

Образец цитирования: Denzler KL, Waters R, Jacobs BL, Rochon Y, Langland JO (2010) Регулирование экспрессии воспалительных генов в PBMC с помощью иммуностимулирующих растений.PLoS ONE 5 (9): e12561. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0012561

Редактор: Йорн Коерс, Медицинский центр Университета Дьюка, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 30 апреля 2010 г .; Одобрена: 22 июля 2010 г .; Опубликовано: 3 сентября 2010 г.

Авторские права: © 2010 Denzler et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Финансирование было предоставлено Институтом биодизайна Университета штата Аризона и Юго-западным колледжем натуропатической медицины. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Доктор Иван Рошон, владелец Herbal Vitality Inc., не оказал финансовой поддержки этому проекту. Роль доктора Рочона в проекте заключалась в получении и предоставлении проверенных растительных продуктов и приготовлении растительных экстрактов, используемых в исследовании.Представленные результаты и подготовленные выдержки не связаны ни с какими патентными заявками, ни с разработкой продаваемых продуктов. Эта принадлежность не влияет на совместное использование представленных данных или описанных материалов.

Введение

Считается, что многие подходы и вмешательства в дополнительной и альтернативной медицине (САМ) усиливают иммунную функцию. Растительные добавки используются во всем мире для усиления иммунного ответа и уменьшения симптомов, связанных с патогенами [1].Для многих людей, особенно тех, кто живет в странах третьего мира, лекарственные травы являются единственным доступным терапевтическим средством. В 1985 году Всемирная организация здравоохранения подсчитала, что, возможно, 80% населения мира полагалось на травы для нужд первичной медико-санитарной помощи [2], [3], [4], [5]. Такое широкое использование лекарственных трав не ограничивается развивающимися странами, поскольку, по оценкам, от 12 до 31% пациентов в европейских странах используют лекарственные травы [2], [3], [4], [5], [6] . В Соединенных Штатах почти каждый пятый американец в настоящее время использует ту или иную форму CAM [3].В журнале Американской медицинской ассоциации сообщается, что в период с 1990 по 1997 год распространенность использования лечебных трав в США увеличилась на 380% [7]. Многие исследования на животных и ограниченные клинические исследования продемонстрировали эффективность растительных средств, таких как Astragalusmbranaceus , в отношении иммуностимулирующего действия [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. Даже при широком использовании и признании полное понимание биохимии и механизмов действия лекарственных средств на травах остается в значительной степени неизвестным [21], [22].

Фактические лекарственные отношения между растениями и людьми исторически далеко идущие. Древние цивилизации, еще в 2800 г. до н.э., использовали методологии трав, которые только сейчас были признаны западной наукой [23]. Во всем мире, но особенно в Европе и Азии, произошли огромные изменения в использовании и признании травяной медицины. По оценкам, в Европе ежегодно на растительные продукты тратится более 2 миллиардов долларов, а в Германии не менее 10% фармацевтического рынка составляют лекарственные средства на основе лекарственных растений [2], [4].Травяные продукты также представляют собой важную экономическую силу в Соединенных Штатах, с оценкой годового объема продаж в 3,3 миллиарда долларов в 1998 году [3]. Растущее использование дополнительной и альтернативной медицины постепенно получает поддержку благодаря расширению исследований, проводимых научными исследователями.

Традиционная фитотерапия использует многие растения, которые, как считается, повышают сопротивляемость организма болезням за счет воздействия на иммунную систему. Исследования на животных и клинические исследования показывают, что многие экстракты растений обладают противоопухолевым, провоспалительным и противоинфекционным действием [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [ 15], [16], [17], [18], [19], [20], [21].Считается, что большинство трав для иммунной системы действуют как общие стимуляторы иммунной системы и, как полагают, изменяют иммунную функцию посредством динамической регуляции экспрессии цитокинов [21]. Echinacea spp. является одним из самых продаваемых ботанических лекарств в Северной Америке. Хотя до сих пор ведутся споры, это растение, по-видимому, проявляет свою противовирусную активность в первую очередь за счет стимуляции иммунной системы [1], [24], [25]. Аналогичным образом Astragalus spp. является одной из основных трав в китайской медицине, которая используется в Европе и Азии для противомикробного действия [26], [27], [28].Исследования показывают, что Astragalus spp. экстракты могут иметь некоторую прямую антибактериальную активность против грамположительных и отрицательных бактерий, в то время как исследования in vivo показывают положительное воздействие на пациентов и животных, инфицированных ВПГ, ВИЧ, ВГВ или вирусным миокардитом [8], [27], [29], [30] ]. Считается, что противовирусная активность астрагала в основном обусловлена модулирующим действием на иммунную систему, в частности, за счет индукции провоспалительных цитокинов [21], [25], [31]. Хотя влияние на экспрессию цитокинов многими растениями было исследовано, количество измеряемых цитокинов было ограничено.Наиболее часто изучаемыми цитокинами являются IL1, IL2, IL4, IL6, TNF и IFNgamma [21]. Эти цитокины являются важными провоспалительными медиаторами и регуляторами иммунного ответа, но дают ограниченное представление о специфической иммунологической активности.

Ботаногеномика (также называемая гербогеномикой) определяется как анализ биологического действия определенного ботанического лекарства посредством профилирования затронутых геномных или протеомных изменений [20]. Эта методология может дать новое понимание механизма эффективности конкретного травяного препарата.Целью этого исследования было выявить и предоставить дополнительную информацию о воспалительных генах, индуцированных в PBMC после лечения иммуномодулирующими экстрактами трав. Эти данные могут дать лучшее понимание того, как эти травы могут вызывать физиологические реакции, наблюдаемые у людей после приема различных иммуностимулирующих растительных продуктов. Хотя многие исследования сосредоточены на выявлении ключевых активных компонентов, присутствующих в растительном экстракте, цель этого исследования заключалась в том, чтобы измерить изменения в генетической экспрессии в клетках, обработанных полными экстрактами трав, которые обычно прописываются отдельным лицам.Используя микроматричный анализ, были идентифицированы новые гены, которые могут участвовать в иммуностимулирующих ответах, а также другие известные биологические эффекты этих трав. Это обеспечивает более полное понимание потенциального механизма действия, эффективности и глобального генетического воздействия этих общих растительных экстрактов на клетки.

Материалы и методы

Препарат ботанический экстракт

В этом исследовании использовались следующие травы: Astragalusmbranaceus, Sambucus cerulea, Andrographis paniculata, Echinacea angustifolia, Urtica dioica и Tylophora asmatica.Свежие выращенные в дикой природе 6–8-дюймовые лиственные верхушки Urtica dioica были собраны в западном Вашингтоне, свежие цветы Sambucus cerulea были собраны в северной центральной части штата Вашингтон, а свежие корни Echinacea angustifolia были собраны в центральном Канзасе. Все свежие растения были отправлены в ночное время экспресс-отправкой на производственный объект для немедленной проверки и обработки. Свежий растительный материал был подтвержден с использованием таксономических ключей. Сушеные ломтики корня астрагала перепончатого и сушеная трава Andrographis paniculata были приобретены у Mayway Corporation (Окленд, Калифорния), а сушеные цельные листья Tylophora indica были приобретены у Hillgreen Company (Бангалор, Индия).Высушенный растительный материал был подтвержден с использованием монографий по фармакопее трав. Свежие растения смешивали с дистиллированной водой / этанолом / глицерином крепостью 190 в соотношении 1–2,5 ( Urtica и Sambucus ) или 1–3 ( Echinacea ) [масса растения к объему жидкости], осторожно измельчали. в блендере Hamilton Beach из нержавеющей стали на 1 галлон, и смесь травы и жидкости переносили в чистую стеклянную банку янтарного цвета, галлонов и закрывали. Высушенные растительные растения измельчали в блендере Hamilton Beach из нержавеющей стали емкостью 1 галлон, переносили в чистую стеклянную банку, окрашенную в галлон янтарного цвета, и добавляли смесь дистиллированная вода / этанол / глицерин крепостью 190 в соотношении 1-5 (вес ботанического продукта к объем жидкости).Дистиллированная вода / этанол / глицерин крепостью 190 были следующими ( Astragalus 74/26/0; Andrographis 69/26/5; Sambucus 58/37/5; Urtica 55/37/8; Эхинацея 48/47/5; Tylophora 32/63/5). Смеси выдерживали при комнатной температуре от 2 до 6 недель с последующим отделением жидкой части от твердой части травы с помощью механического пресса. Экстрагированную жидкость фильтровали с использованием небеленых бумажных фильтров, объединяли и разливали в бутылки янтарного цвета.Образец каждого экстракта был высушен, и было обнаружено, что все экстракты содержат аналогичные концентрации нелетучих растворенных веществ (в диапазоне от 62,4 до 136,8 мг / мл экстракта).

Количественное определение эндотоксинов

Уровни эндотоксина в экстрактах растений определяли с помощью набора для анализа эндотоксинов Genscript ToxinSensor Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit. Протокол производителя соблюдался, и единицы эндотоксина / мл (EU / мл) определялись путем сравнения со стандартным раствором Escherichia coli .

Выделение PBMC : PBMC человека были получены из коммерческого источника (Lonza, Inc., Allendale, NJ) или из свежеполученной крови. Коммерчески полученные PBMC выделяли из периферической крови аферезом и центрифугированием в градиенте плотности. Клетки помещали на сухой лед и хранили в жидком азоте до использования.

Для свежих PBMC кровь собирали венепункцией в гепаринизированные пробирки. Цельную кровь удаляли и добавляли к равному объему сбалансированного солевого раствора (0.01% D-глюкоза, 0,005 мМ CaCl ₂, 0,098 мМ MgCl ₂, 0,54 мМ KCl, 14,5 мМ Трис, pH 7,6, 126 мМ NaCl). Сорок мл раствора крови / соли наносили на 10 мл Ficoll-Paque Plus (Amersham Biosciences) и центрифугировали при 400 × g в течение 40 минут при 20 ° C. РВМС удаляли с поверхности раздела и промывали сбалансированным солевым раствором. Коллекция свежих PBMC была одобрена институциональными наблюдательными советами Университета штата Аризона и Юго-западного колледжа натуропатической медицины (SCNM).Участники были набраны из SCNM, а анализы крови выполнялись в Медицинском центре SCNM. Все участники получили и заполнили письменную форму информированного согласия до участия в исследовании.

Обработка клеток

PBMC ресуспендировали в RPMI1640 с 10% фетальной бычьей сывороткой (1 × 10 ⁶ клеток / мл) в чашках для культивирования клеток. 1 × 10 ^{7 клеток} (в 10 мл среды) обрабатывали 5 мкл экстракта трав или носителя (этанол) в течение указанного времени (3–18 часов).Обработку клеток форбол-12-миристат-13-ацетатом (PMA) (Calbiochem) проводили до конечной концентрации 50 нМ.

Выделение РНК : После обработки (3–18 часов) общая РНК была выделена и очищена в соответствии с протоколом производителя с использованием набора RNeasy (Qiagen). Вкратце, клеточный лизат гомогенизировали с использованием спин-колонки QIAshredder. Любое загрязнение ДНК удаляли расщеплением ДНКазой, и РНК выделяли с использованием спин-колонки RNeasy.

Анализ микрочипов

Один мкг тотальной РНК высокого качества был преобразован в двухцепочечную кДНК с использованием набора Affymetrix One-Cycle Target Labeling Kit с использованием праймера oligo-dT, содержащего промотор РНК-полимеразы Т7.Двухцепочечную кДНК очищали с использованием модуля очистки образцов Affymetrix GeneChip Sample Cleanup Module, а меченную биотином кРНК получали с использованием набора One-Cycle Kit. Меченую биотином кРНК очищали с использованием модуля GeneChip Sample Cleanup Module, количественно определяли на спектрофотометре и анализировали на 1% агарозном геле TAE для проверки широкого распределения размеров транскриптов кРНК. Затем кРНК фрагментировали примерно до 35-200 п.н. щелочной обработкой (200 мМ трис-ацетат, pH 8,2, 500 мМ KOAc, 150 мМ MgOAc) и фрагментацию проверяли на 1% агарозном геле TAE.Отдельные коктейли гибридизации готовили с использованием 15 мг фрагментированной кРНК из каждого образца.

В общей сложности 200 мкл каждого коктейля гибридизации гибридизовали с массивом Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 в течение 16 часов при 45 ° C в печи для гибридизации 640. Матрица Human Genome измеряет экспрессию более 47000 транскриптов и вариантов, включая приблизительно 38 500 хорошо изученных генов человека. Массивы промывали на Affymetrix GeneChip Fluidics Station 450 в соответствии с инструкциями производителя с использованием первичного красителя стрептавидин-фикоэритрина (SAPE), последующего окрашивания биотинилированными антителами и вторичного окрашивания SAPE.После гибридизации и отмывки массивы сканировали с использованием Affymetrix GeneChip Scanner 3000 7G. Отсканированные изображения, полученные с помощью программного обеспечения Affymetrix GeneChip Operating Software (GCOS) v1.2, использовались для извлечения значений интенсивности необработанного сигнала для каждого зонда, установленного на массиве, и расчета вызовов обнаружения (отсутствующих, маргинальных или присутствующих). Назначение вызовов обнаружения основывалось на интенсивностях пар зондов, для которых один зонд идеально соответствовал эталонной последовательности, а другой был зондом несоответствия, для которого было изменено тринадцатое основание (эталонной последовательности 25-олигонуклеотидов).Все необработанные данные чипов были масштабированы в GCOS до 150, чтобы нормализовать интенсивности сигналов для сравнений между массивами. Отчеты, созданные в GCOS, оценивались для каждого массива, чтобы проверить наличие эукариотических элементов управления, максимальные коэффициенты масштабирования примерно 3, не менее 30% текущих вызовов (фактические данные варьировались от 37 до 48%) и максимальные отношения GAPDH (3 ‘/ 5’). из 3,0. Все данные микроматрицы совместимы с MIAME, а полные данные экспрессии микроматрицы депонированы и доступны в базе данных, совместимой с MIAME, по адресу: http: // www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE19128.

Количественная ПЦР в реальном времени

Результаты микроматрицы были подтверждены количественной ПЦР в реальном времени (qPCR). Десять репрезентативных генов были отобраны из профилей экспрессии микроматрицы, и изменения в уровне экспрессии подтвердили с помощью qPCR. КПЦР выполняли с использованием смеси iQSYBR Green Super (Bio-Rad). Вкратце, матрицу кДНК для каждого изолята добавляли в лунки, содержащие реакционную смесь для ПЦР (смесь iQSYBR Green Super и праймеры).Праймеры были получены от SABiosciences. Реакции проводили в системе обнаружения ПЦР в реальном времени MiniOpticon с программным управлением CFX Manager (Bio-Rad).

Анализ проточной цитометрии

Клетки

THP-1 выращивали в RPMI1640 с 10% FBS в неприлипающих пластиковых чашках. Клетки обрабатывали супернатантом либо имитирующих обработанных PBMC, либо PBMC, обработанных PMA или экстрактом астрагала в течение 18 часов. Один миллион клеток промывали и ресуспендировали в PBS, содержащем 1% BSA, 0,1% азида натрия и 30% сыворотки AB человека (Innovative Research) с последующим окрашиванием в течение 30 минут антителами, специфичными для CD11b (клон ICRF44), CD14 (клон MphiP9). или с контролем изотипа.Антитела приобретали в виде конъюгатов PE-Cy7 или APC-Cy7 (BD, Сан-Хосе, Калифорния). Иодид пропидия использовали для исключения мертвых клеток из анализа. Флуоресценцию клеток анализировали на образцах из 20 000 клеток, используя BD Bioscience FACSAria с программным обеспечением FACSDiVa.

Результаты

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) часто считаются отраслевым стандартом для исследования многих аспектов иммунологического ответа в системе культивирования клеток. Как смешанная популяция Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, естественных клеток-киллеров, моноцитов, макрофагов и дендритных клеток, PBMC представляют собой ключевые клетки, участвующие в генетической экспрессии цитокинов, ведущих к врожденным и адаптивным иммунным и воспалительным ответам.Для исследования цитокинового ответа, индуцированного иммуностимулирующими растительными экстрактами, PBMC обрабатывали травяным экстрактом с последующим микрочиповым анализом изолированной клеточной РНК. На сегодняшний день эффект иммуностимулирующих трав оценивался только путем наблюдения экспрессии ограниченного числа цитокинов. Такие исследования могут вводить в заблуждение и не дают широкого или полного представления о влиянии экстракта трав на иммунные клетки. В наших исследованиях 1 × 10 ⁷ клеток обрабатывали 5 мкл травяного экстракта в течение 18 часов.Эта концентрация была основана на средней дозе, предписанной человеку, по отношению к приблизительному общему объему крови (2,5 мл экстракта на 5 л крови). После инкубации с экстрактом общую РНК очищали от клеток и оценивали уровни экспрессии мРНК с помощью анализа микрочипов с использованием платформы Affymetrix.

Эти исследования проводились с использованием травяных экстрактов, которые исторически использовались для повышения иммунной активности у пациентов, включая Astragalusmbranaceus (корень молочной веточки, Huang qi), Sambucus cerulean (голубая бузина) и Andrographis paniculata (India Echinacea, Король горечи).Поскольку эти экстракты были приготовлены в водном носителе, содержащем этанол и глицерин, РВМС обрабатывали этанолом и глицерином в одинаковых концентрациях в дистиллированной воде (этанол) в качестве контроля. Наш первоначальный метод измерения модуляции экспрессии генов был выполнен с использованием анализа диаграммы разброса. Обработка PBMC раствором носителя почти не влияла на экспрессию гена по сравнению с необработанными PBMC (рис. 1A, график A). Однако, как показано на рисунке 1A, обработка PBMC экстрактом Astragalus привела к изменению экспрессии многих клеточных генов (сравните диффузное рассеяние на рисунке 1A, график A с графиком B).На этом рисунке диагональные линии от центра представляют 2-, 3-, 10- и 30-кратные уровни индукции или репрессии экспрессии генов. При обработке Astragalus была изменена экспрессия нескольких сотен клеточных генов, многие из которых достигли уровней более чем в 30 раз по сравнению с обработкой только этанолом (рис. 1A, график B). Индукция экспрессии гена была больше, чем уровень репрессии гена в отношении относительного кратного изменения и количества измененных генов (146 генов, индуцированных при 58%, индуцированных более чем в 10 раз против 118 генов, подавленных при 21% подавлен более чем в 10 раз).Аналогичный вид диаграммы разброса наблюдался после обработки Sambucus (рис. 1A, график C). После обработки PBMC с помощью Andrographis наблюдались аналогичные кратные изменения индукции / репрессии, но, по-видимому, было затронуто меньшее количество генов (рис. 1A, график D). Поскольку все три из этих иммуностимулирующих травяных экстрактов давали относительно похожие профили диаграммы разброса, был изучен экстракт, приготовленный из иммуносупрессивного растения, Urtica dioica, . Обработка клеток Urtica привела к очень ограниченным или низким уровням изменений в экспрессии клеточных генов (рис. 1A, график E).Отсутствие изменений в экспрессии генов после обработки Urtica свидетельствует о том, что изменение экспрессии генов иммуностимулирующими экстрактами (например, Astragalus) не было связано с неспецифическим эффектом любого ботанического экстракта , а вместо этого был законный эффект из-за специфических компонентов, присутствующих в иммуностимулирующих растительных экстрактах. Неудивительно, что экстракт Urtica не изменял экспрессию гена, поскольку PBMC были получены от предположительно здорового человека, и иммуносупрессивные эффекты, вероятно, не наблюдались.Этот эффект наблюдался ранее, когда пероральное введение экстракта Urtica не влияло на экспрессию цитокинов у здорового человека и только подавляло экспрессию цитокинов после индукции липополисахарида [32].

Рисунок 1. Точечная диаграмма, представляющая регуляцию экспрессии генов растительным экстрактом.

Данные проанализированных генов с помощью микроматрицы были нанесены на график для сравнения различий в экспрессии генов при обработке PBMC растениями и этанолом (часть A).Каждое пятно на графиках представляет определенный ген. Показаны только гены с присутствующими вызовами в обоих вариантах лечения. Диагональные линии от центра представляют 2-, 3-, 10- и 30-кратные уровни индукции или репрессии экспрессии генов. Часть B иллюстрирует сравнительный анализ различных ботанических обработок PBMC.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0012561.g001

Хотя PBMC представляют собой первичные иммунные клетки, участвующие в производстве цитокинов, другие типы клеток также могут участвовать в иммунных и воспалительных реакциях, связанных с этими экстрактами растений.Поэтому использовали линию кишечных клеток, клетки Caco2, и измеряли изменения в экспрессии генов после обработки растительными экстрактами. Результаты продемонстрировали отсутствие резких изменений в экспрессии генов после обработки любым из растительных экстрактов (данные не показаны). Поскольку PBMC являются ключевыми клетками, участвующими в производстве цитокинов, эти результаты предполагают, что активные компоненты в этих растительных веществах могут взаимодействовать с клетками в популяции PBMC, что приводит к изменениям в экспрессии цитокинов.

Результаты микроматрицы обработанных PBMC были подтверждены количественной ПЦР в реальном времени (qPCR). Десять репрезентативных генов были отобраны из профилей экспрессии микроматрицы, и изменения в уровне экспрессии подтвердили с помощью qPCR. Все десять генов, протестированных с помощью кПЦР, показали уровни экспрессии, сравнимые с уровнями, полученными при анализе микрочипов (таблица 1). Судя по нашему предыдущему опыту с исследованиями микрочипов, значительных различий между уровнями экспрессии, определенными с помощью микроматричного анализа или количественной ПЦР, не наблюдалось [33].

Для сравнения профилей экспрессии генов, измененных травами, были построены сравнительные диаграммы разброса между иммуностимулирующими травами. Как показано на рисунке 1B (график A), гены, измененные с помощью Sambucus и Astragalus , были очень похожи, на что указывает отсутствие диффузного рассеяния генов. Обработка Astragalus действительно привела к дополнительным изменениям в экспрессии генов по сравнению с Sambucus , на что указывают несколько генов, специфически индуцированных Astragalus в 3–10 раз. Эти специфические изменения Astragalus произошли в отношении уникальных генов, а также генов, регулируемых как Astragalus , так и Sambucus , но были индуцированы до более высокого уровня экспрессии после обработки Astragalus (рис. 2). Больше различий в экспрессии генов наблюдали при сравнении Astragalus и Andrographis или Sambucus с Andrographis (рис. 1B, график B и график C, соответственно).Опять же, гены, измененные этими сравнительными травами, были подобны, но каждая трава также индуцировала уникальный набор генов (данные не показаны и на Рисунке 2). Эти данные свидетельствуют о том, что иммуностимулирующие травы могут последовательно влиять на общий набор генов, а также оказывать дополнительные уникальные эффекты на экспрессию генов.

Рисунок 2. Экспрессия гена-хозяина регулируется обработкой PBMC Astragalusmbranaceus .

Гены были отсортированы на основе трехкратного ( P <0,01) или более высокого уровня индукции для PBMC, обработанных Astragalus , в течение 18 часов (колонка Astra).Показаны только гены, участвующие в иммунном / воспалительном ответе. Изменения (n-кратные) уровня экспрессии по сравнению с таковыми для клеток, обработанных этанолом, показаны в каждом поле. Красные прямоугольники представляют гены, индуцированные в 100 раз или больше, оранжевые прямоугольники представляют гены, индуцированные в 10-100 раз, а желтые прямоугольники представляют гены, индуцированные в 3-10 раз. Дополнительные ботанические обработки включают Sambucus cerulea (колонка Sambu) и Andrographis paniculata (колонка Andro).

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0012561.g002

Клеточные гены, индуцированные и репрессированные после обработки Astragalus , были идентифицированы как (а) те гены, которые лежат за пределами профиля диаграммы разброса необработанной обработки по сравнению с обработкой этанолом (рис. 1А, График A) и (b) те гены, экспрессия которых была изменена по меньшей мере в 3 раза по сравнению с обработкой только этанолом. Исходя из нашего опыта и других исследований микрочипов, изменение в 2,5 раза или выше обычно считается значительным; поэтому ограничение нашего кратного изменения 3-кратным или более высоким уровнем дает твердую уверенность в достоверности того, что экспрессия этих генов действительно изменялась [33].После обработки PBMC экстрактом Astragalus индуцировалось приблизительно 150 генов (данные не показаны). Известно, что по крайней мере 65% генов, индуцированных Astragalus , имеют функции, участвующие в иммунном / воспалительном ответе. На рис. 2 (столбец Astra) показаны иммунные / воспалительные гены, индуцированные при лечении экстрактом Astragalus .

Предыдущие исследования Astragalus показали, что лечение приводит к (а) увеличению фагоцитарной активности макрофагов, (б) увеличению провоспалительных цитокинов ИЛ1, ИЛ6 и ФНО и (в) увеличению уровней стимулирующих лимфоциты ИЛ2 и ИЛ2. экспрессия рецептора [14], [21], [34], [35].Применение Astragalus в иммунных и воспалительных целях включает противомикробную терапию [26], [27], [28], лечение лейкемии и рака легких [35], [36], [37] и заживление ран [35], [ 38]. Основываясь на литературе и неофициальных данных, лечение Astragalus может быть связано с повышенным риском кровотечения и эффектами снижения артериального давления [39], [40]. Гены, индуцированные в нашем исследовании обработкой Astragalus , хорошо согласуются с этими предыдущими исследованиями и физиологическим воздействием травы на организм.В PBMC были сильно индуцированы индуцированные / взаимодействующие белки IL-1, IL-1, IL-6 и TNF-альфа (например, TNFAIP6), а также гены, участвующие в стимуляции иммунных клеток, хемотаксисе, экстравазации и созревании / дифференцировке (рис. 2). Кроме того, гены, участвующие в повышенном риске кровотечения (например, тромбомодулин, моноаминоксидаза), регуляция артериального давления (например, адреномедуллин, простагландинэндопероксидсинтаза 2 [циклооксигеназа-2], моноаминоксидаза) и заживление ран (эпирегулин, фибронектинового типа. III, гепарин-связывающий EGF-подобный фактор роста, интерлейкин 24) (рис. 2).Эффект Astragalus на экспрессию большинства этих генов ранее не был показан и может дать новое понимание физиологических эффектов этого растения.

В подтверждение сравнительных диаграмм разброса (рис. 1В) очень похожий набор генов, регулируемых экстрактом Astragalus , также регулируется экстрактом Sambucus (рис. 2, сравните столбец Astra с столбцом Sambu). Это говорит о том, что схожие физиологические активности присутствуют в обоих растительных экстрактах, однако активные компоненты могут быть уникальными (т.е., сохранение функции с различными химическими составляющими). Обработка клеток экстрактом Andrographis также изменила многие гены, общие с Astragalus , но в целом уровень индукции генов, регулируемых Andrographis, был ниже (рис. 2, столбец Andro).

Моноциты представляют собой значительный процент клеток, присутствующих в популяции PBMC. Они могут созревать в макрофаги или дифференцироваться в дендритные клетки (ДК) при миграции в ткани.Моноциты, созревшие в макрофаги, становятся более прилипающими к поверхностям культур тканей и повышают экспрессию интегринов CD11 / CD18 [41], [42]. Чтобы проверить созревание моноцитов, PBMC обрабатывали экстрактом астрагала и анализировали влияние на прикрепление клеток. Как показано на рисунке 3A (верхние панели), обработка PBMC экстрактом астрагала приводила к увеличению количества прикрепленных клеток. Количественно количество прикрепленных клеток увеличилось примерно в 15 раз. Эти результаты предполагают, что обработка PBMC иммуностимулирующим растением, таким как астрагал, не только увеличивает транскрипцию связанных с иммунитетом генов, но и что эти генные продукты вызывают созревание и / или дифференцировку иммунных клеток.Известно, что IL4 и GM-CSF созревают моноциты в направлении DC и что IL6 направляет созревание моноцитов в первую очередь в направлении макрофагов [43]. При обработке PBMC экстрактом астрагала экспрессия IL6 сильно повышалась (фиг. 2), тогда как экспрессия IL4 и GM-CSF не изменялись. Эти результаты предполагают, что созревание моноцитов, наблюдаемое при обработке экстрактом астрагала, может быть направлено в сторону макрофагального происхождения. Это согласуется с предыдущими данными, в которых было показано, что изолированный полисахарид APS из астрагала индуцирует активацию макрофагов [44].Чтобы выяснить, было ли это созревание моноцитов прямым действием экстракта на моноциты, тестировали созревание моноцитов в макрофаги после обработки экстрактом астрагала с использованием клеточной линии моноцитов THP-1. Обработка этих клеток экстрактом астрагала не привела к значительному увеличению количества прикрепленных клеток по сравнению с необработанными или обработанными этанолом клетками, что свидетельствует об отсутствии прямого воздействия экстракта на созревание моноцитов и макрофагов (рис. 3А, нижние панели). Созревание моноцитов, наблюдаемое в популяции PBMC, может быть связано с цитокинами, высвобождаемыми из других отвечающих клеток, присутствующих в популяции PBMC (например,g., Т-хелперные клетки). Чтобы проверить это, бесклеточные культуральные среды из необработанных или обработанных астрагалом PBMC (через 24 часа после обработки) добавляли к клеткам THP-1. Как показано на фиг. 3B, увеличение количества прикрепленных клеток наблюдалось в клетках THP-1, обработанных бесклеточной средой из PBMC, обработанных Astragalus, но не из необработанных PBMC. В качестве контроля бесклеточную среду из PBMC, обработанных PMA, добавляли к клеткам THP-1. Аналогичное увеличение количества прикрепленных клеток наблюдалось при использовании бесклеточной среды из клеток, обработанных PMA, или клеток, обработанных астрагалом (рис. 3B).Эти результаты предполагают, что индуцированное астрагалом созревание моноцитов в популяции PBMC было обусловлено вторичным эффектом после высвобождения цитокинов из клеток-респондентов.

Рисунок 3. Обработка PBMC Astragalusmbranaceus привела к созреванию моноцитов.

Часть A) PBMC (верхние панели) или линия клеток моноцитов THP-1 (нижняя панель) не обрабатывали, обрабатывали этанолом (25%) или обрабатывали экстрактом Astragalus в течение 18 часов. После обработки неприкрепленные клетки были удалены, а оставшиеся прикрепленные клетки сфотографированы.Часть B) PBMC не обрабатывали или обрабатывали экстрактом Astragalus или PMA в течение 18 часов. Через 18 часов среду для культивирования клеток удаляли и клетки осаждали центрифугированием. Бесклеточную культуральную среду добавляли к клеткам THP-1 на дополнительные 24 часа. После обработки неприкрепленные клетки были удалены, а оставшиеся прикрепленные клетки сфотографированы. Часть C) Бесклеточную среду из PBMC, обработанных ложным, астрагалом или PMA, добавляли к клеткам THP-1 и инкубировали в непокрытых пластиковых чашках.Через 48 часов клетки промывали и окрашивали антителами, конъюгированными с флуорохромом, специфичными для CD14 и CD11b, с последующим анализом проточной цитометрии. Часть D) Бесклеточная среда, полученная из PBMC, выделенных от двух пациентов, была использована для лечения клеток THP-1 и проанализирована на экспрессию CD14 и CD11b, как в Части C. Указанные значения представляют общее количество клеток CD14, общее количество клеток CD11b и двойное количество CD14 / CD11b. положительные клетки. Данные были нормализованы к образцам, подвергнутым имитационной обработке.

https://doi.org/10.1371 / journal.pone.0012561.g003

Созревание клеток THP-1 в бесклеточной среде дополнительно контролировали по экспрессии антигена CD14 и по экспрессии компонента интегрина β2, CD11b, оба из которых активируются, когда этот промоноцитарный линия клеток дифференцируется в зрелые моноцитные / макрофагоподобные клетки [45]. Инкубация клеток THP-1 с бесклеточной средой из PBMC, подвергнутых ложной обработке, привела к 15,4% клеток, экспрессирующих CD11b, в то время как инкубация с бесклеточной средой из PBMC, обработанных Astragalus или PMA, дала 28 клеток.5% или 28,6% клеток, экспрессирующих CD11b, соответственно. Ранее было показано, что присутствие ассоциированных с адгезией молекул на моноцитах не обязательно коррелирует с адгезией к субстрату, но что адгезия требует внутриклеточной передачи сигналов, которая конформационно активирует молекулу адгезии [46]. Таким образом, обработанные имитацией клетки THP-1 могут экспрессировать неактивную форму CD11b, которая не опосредует прилипание (рис. 3С). Инкубация клеток THP-1 с бесклеточной средой из PBMC, обработанных ложным или PMA, дала 3.4% и <1% клеток, экспрессирующих CD14, соответственно. Инкубация с бесклеточной средой из PBMC, обработанных астрагалом, привела к экспрессии CD14 в 50,3% клеток. Кроме того, экстракты из PBMC, обработанных Astragalus , вызвали 4,5-кратное увеличение процента дважды положительных клеток, экспрессирующих как CD14, так и CD11b, по сравнению с PBMC, обработанными ложно. На фигуре 3D показаны усредненные уровни экспрессии общих CD14 или CD11b-положительных клеток и CD14 + CD11b + двойных положительных клеток, нормализованные до фиктивных уровней, из PBMC, выделенных от двух разных пациентов.Хотя бесклеточная среда как из PBMC, обработанных Astragalus , так и из РМА, индуцировала созревание, что измерялось по клеточной адгезии и увеличению процентного содержания всех клеток CD11b +, только среда из PBMC, обработанных Astragalus , индуцировала экспрессию CD14.

В целом, профиль гена цитокинов, индуцированный после лечения Astragalus , не был сильно направлен ни на Th2, ни на Th3-ответ, а скорее на более общий или препаративный иммунный / воспалительный ответ (см. Рисунок 2).Большинство генов, участвующих в определении ответа Th2 или Th3, остаются неизменными (например, Th2: IFNgamma, IL18, SOCS1, STAT1, CSF2; Th3: IL13, IL4, IL5, ICOS). Однако профили экспрессии генов были определены в отношении созревания человеческих моноцитов и макрофагов и поляризации по фенотипам M1 или M2 [47]. Как показано на фиг. 4, профиль экспрессии генов PBMC, обработанных Astragalus , следует поляризации M1 (как с индуцированными, так и с репрессированными генами), при этом 83% генов, определяющих поляризацию макрофагов M1 / M2, совпадают с таковой для линии M1.В соответствии с этим, ЦОГ-2, который был сильно индуцирован после лечения Astragalus (рис. 2), долгое время ассоциировался и индуцировался в макрофагах M1 [48]. Сходным образом COX-1, который активируется в макрофагах M2 [47], был немного подавлен после обработки Astragalus (данные не показаны). Эти результаты предполагают, что обработка Astragalus созревала моноцитами в направлении поляризации M1.

Рисунок 4. Транскрипционный профиль поляризации макрофагов M1 / M2, индуцированной Astragalusmbranaceus.

Показаны гены человека, участвующие в определении поляризации M1 / M2 [47]. Эффект регуляции транскрипции каждого гена после обработки PBMC экстрактом Astragalus указан (столбец «Экспрессия»), при этом положительные значения представляют повышенную экспрессию, а отрицательные значения — подавленную экспрессию. Знак «X» (в столбце «M1 like» или M2 like ») указывает на то, что изменение экспрессии гена (индуцированное или подавленное) после обработки Astragalus было аналогично тому, которое ранее наблюдалось после созревания моноцитов до M1-подобного или М2-подобная поляризация макрофагов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0012561.g004

Поскольку представленные до сих пор данные микроматрицы представляют собой обработку одной популяции PBMC из коммерческого источника (Lonza, Inc. [идентифицировано как набор PBMC I] ), мы хотели подтвердить, что подобная модуляция генов будет происходить в свежих PBMC человека. Свежие РВМС получали и очищали, как описано в разделе «Материалы и методы» (обозначены как РВМС, набор II). После обработки этих клеток экстрактом Astragalus было обнаружено, что индуцировалось 123 гена (фиг. 5A, набор II PBMC), что давало ответ, аналогичный тому, который наблюдали с коммерчески доступными PBMC, набором I PBMC (индуцировано 146 генов).Подобно набору I PBMC, гены, индуцированные в наборе II PBMC, в первую очередь играли иммунную / воспалительную роль (65% против 62%, соответственно). Хотя многие из индуцированных воспалительных генов были разными в двух популяциях PBMC, более 30% индуцированных генов были идентичными. Этот уровень идентичности является высоким, учитывая, что PBMC были получены от разных индивидуумов в свежем и замороженном виде. Обычно индуцируемые гены, вероятно, являются многими ключевыми игроками, участвующими в известных физиологических ответах на Astragalus , включая те, которые участвуют в активации, дифференцировке и хемотаксисе иммунных клеток (например,CCL3, CCL4, CXCL1, CXCL2, CXCL3, IL1alpha, IL1beta, IL6 и IL8), а также заживление ран и свертывание крови (например, фактор свертывания крови III, эндопероксид-синтаза простагландина 2, тромбомодулин и IL24) (см. Рисунок 5B, панель А).

Рисунок 5. Различные изоляты PBMC привели к аналогичным изменениям в экспрессии генов после обработки Astragalusmbranaceus.

Коммерчески доступные (набор РВМС I) или свежие РВМС (набор РВМС II) обрабатывали экстрактом Astragalus в течение 18 часов.Гены были отсортированы на основе трехкратного ( P <0,01) или более высокого уровня индукции или репрессии по сравнению с обработкой этанолом. Часть A представляет собой общее сравнение генов, регулируемых между набором I PBMC и набором II PBMC. Для части B показаны специфические иммунные / воспалительные гены, экспрессия которых обычно или однозначно изменяется после обработки Astragalus набора I PBMC и набора II PBMC. Изменения (n-кратные) уровня экспрессии по сравнению с таковыми для клеток, обработанных этанолом, показаны в каждом поле.Красные прямоугольники представляют гены, индуцированные в 100 раз или более, оранжевые прямоугольники представляют гены, индуцированные в 10-100 раз, а желтые прямоугольники представляют гены, индуцированные в 3-10 раз.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0012561.g005

Гены, которые были индуцированы только в одном из наборов PBMC, вероятно, связаны с человеческими генетическими вариациями и / или физиологическим состоянием человека в то время. крови. Многие из уникально индуцированных генов представляют собой функциональные семейства генов.Например, в наборе I PBMC после обработки Astragalus индуцировалось несколько металлотионеинов, ванинов и интегринов (фигура 5B, панель B). В наборе II PBMC эти семейства генов остались в основном неизменными, однако были индуцированы семейства генов, включая факторы, стимулирующие колонии, фосфатазы с двойной специфичностью, а также остановку роста и индуцируемое повреждение ДНК. Примечательно, что набор II PBMC также привел к уникальной индукции CD69, ответа раннего роста 1 и микроРНК 155, которые являются ключевыми белками, участвующими в воспалительном ответе (фигура 5B, панель B).Предыдущие исследования демонстрируют, что значительные естественные вариации в уровнях экспрессии генов существуют внутри и среди человеческих популяций [49]. Когда они сравнивали людей, вариации экспрессии генов наблюдались примерно в 83% генов. Гены, которые по-разному экспрессируются среди популяций, могут быть особенно важны в качестве кандидатов на заболевание или, в наших исследованиях, на различия в иммунном ответе.

Мы также идентифицировали более 100 клеточных генов, уровни экспрессии которых были подавлены после обработки Astragalus (Рисунок 5A).В этом наборе данных большинство генов (приблизительно 70%) были , а не непосредственно вовлеченными в воспалительный / иммунный ответ, но были генами, участвующими в метаболических путях, таких как метаболизм липидов и углеводов (например, фруктозо-1,6-бифосфатаза 1, фукозидаза, липаза А и альфа-галактозилтрансфераза 1). Эти данные подтверждают идею о том, что эти травы участвуют в индукции системного воспалительного и иммунного ответа. Опять же, когда сравнивали набор I PBMC и набор II PBMC, было подавлено сходное количество и процентное соотношение генов (фиг. 5A), но для тех генов, которые участвуют в воспалительной реакции, репрессированы определенные семейства генов для каждого набора PBMC.Для набора I PBMC репрессированы несколько основных генов класса II комплекса гистосовместимости (фиг. 5B, панель C). Для набора II PBMC репрессированные семейства генов включали рецепторы иммуноглобулинов лейкоцитов, члены семейства C-лектиновых доменов, цитозольные факторы нейтрофилов и металлотионеины (фигура 5B, панель C). В настоящее время трудно предположить, какую роль подавление этих семейств воспалительных генов может играть в физиологических эффектах Astragalus.

Для дальнейшего понимания временного эффекта обработки Astragalus на иммунные клетки, PBMC обрабатывали экстрактом растений, и микроматричный анализ выполняли на образцах РНК, полученных через 3, 8 и 18 часов после обработки.На Фигуре 6A показан график разброса уровней экспрессии генов PBMC, обработанных этанолом, по сравнению с клетками, обработанными экстрактом Astragalus в течение указанного времени. Как показано, клеточная транскрипционная реакция на травяной экстракт была быстрой с резкой индукцией / репрессией нескольких сотен генов через 3 часа после обработки (фиг. 6A, панель A). К 8 и 18 часам после обработки было индуцировано / подавлено меньше генов, но все еще представлено 100-200 генов (рис. 6A, панели B и C).Индукция генов с помощью Astragalus была двухфазной, при этом различные семейства генов индуцировались в разное время после лечения. Как показано на фиг. 6B и 6C, через 3 часа после обработки преобладали гены (приблизительно 40%), участвующие в процессах транскрипции, трансляции и передачи сигнала, и только 26,6% генов имели воспалительную роль. Однако через 8 и 18 часов после обработки примерно 70% индуцированных генов были вовлечены в иммунный / воспалительный ответ (Фигуры 6B и 6C).Иммунные гены, которые были индуцированы через 3 часа после обработки, обычно продолжали индуцироваться в течение 18 часов, включая различные хемокины (CCL3, CCL4, CCL20) и интерлейкины (IL1beta и IL6) (Рисунок 6C). Интересно, что существуют различия в иммунных / воспалительных генах, индуцированных между 8 и 18 часами после лечения. Гены, участвующие в интерфероновом ответе типа I, такие как индуцированная интерфероном 44 и стимулированная интерфероном экзонуклеаза 20 кДа, индуцировались только в 8-часовой временной точке (фиг. 6C).Аналогичным образом, несколько интерлейкинов индуцировались только в 18-часовой временной точке, включая IL12B и IL24 (фигура 6C). Поскольку PBMC содержат множество иммунных клеток, эти временные эффекты могут быть связаны с компонентами, присутствующими в экстракте трав, взаимодействующими с (а) отвечающими клетками, которые впоследствии индуцируют / высвобождают цитокины и приводят к транскрипционным ответам в других эффекторных клетках, или (б) клеткам. которые индуцируют клеточные рецепторы / процессы передачи сигналов, которые после экспрессии могут реагировать на дополнительные растительные компоненты, что приводит к индукции воспалительных генов.

Рисунок 6. Временная регуляция экспрессии генов в PBMC после обработки Astragalusmbranaceus .

PBMC обрабатывали экстрактом Astragalus в течение 3, 8 или 18 часов. Данные генов, проанализированные с помощью микроматрицы, были нанесены на график для сравнения различий в экспрессии генов при обработке PBMC растениями и этанолом (часть A). Каждое пятно на графиках представляет определенный ген. Показаны только гены с присутствующими вызовами в обоих вариантах лечения. Диагональные линии от центра представляют 2-, 3-, 10- и 30-кратные уровни индукции или репрессии экспрессии генов.Часть B представляет роли и общее сравнение генов, индуцированных через 3, 8 и 18 часов после обработки Astragalus . В части C перечислены репрезентативные гены, индуцированные через 3, 8 и / или 18 часов после обработки Astragalus .

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0012561.g006

Липополисахариды (ЛПС) являются основными компонентами внешней мембраны грамотрицательных бактерий и мощными активаторами врожденного иммунного ответа. Взаимодействие ЛПС через CD14 с клетками, такими как макрофаги, гранулоциты и дендритные клетки, приводит к синтезу множества медиаторов воспаления [50], [51].Однако сильные воспалительные реакции на ЛПС могут быть опасными и могут привести к эндотоксиновому шоку и смерти [50], [51]. Поэтому наличие LPS или загрязнения эндотоксинами в фармацевтических препаратах и лекарствах является общей проблемой. Экстракты трав, использованные в этих исследованиях, были проанализированы на наличие эндотоксина с использованием модифицированного набора Limulus Amebocyte Lysate. Как показано на Рисунке 7, травяные экстракты исторически сообщались и использовались для стимуляции иммунного ответа ( Astragalusmbranaceus, Sambucus cerulea, Andrographis paniculata, Echinacea angustifolia и Glycyrrhiza glabra ) [10], [52], [53], [10], [52], [53], [ 54], [55]) имели высокий уровень эндотоксина (> 100 ЕЭ / мл).Те травяные экстракты, которые исторически использовались для подавления иммунной активности ( Urtica dioica и Tylophora asmatica ) [56], [57]), имели гораздо более низкие уровни эндотоксина (<100 EU / мл). Эта корреляция между активностью и концентрацией эндотоксина может указывать на то, что присутствие LPS не было связано с загрязнением экстракта, а вместо этого было обычным компонентом иммуностимулирующих экстрактов и, как таковое, могло играть роль в иммунорегулирующей активности. Чтобы подтвердить, что присутствие ЛПС в экстрактах не было следствием загрязнения во время сбора урожая или приготовления экстракта, были приготовлены несколько экстрактов Astragalus и Urtica с использованием различных партий растительного материала от поставщиков.Как показано на Фигуре 7, все экстракты Astragalus имели высокие уровни эндотоксина (> 100 EU / мл), а все экстракты Urtica имели низкие уровни эндотоксина (<100 EU / мл). Это также подтверждает, что присутствие ЛПС в экстрактах растений не было связано с экзогенным бактериальным заражением во время сбора урожая, обработки или приготовления экстракта, а, скорее всего, было связано с лизисом эндофитных бактерий, которые колонизируют внутреннюю ткань растений в мутуалистических условиях. и бессимптомная мода.Считается, что из почти 300 000 видов растений, существующих на Земле, каждое отдельное растение является хозяином одного или нескольких бактериальных эндофитов [58], [59], [60]. Эндофиты определяются как эндосимбионты, которые живут в растении, не вызывая каких-либо явных заболеваний. Эндофиты обнаруживаются не только в корнях и в ризосфере, но часто обнаруживаются, что они колонизируют межклеточные пространства и были изолированы от всех компонентов растения, включая семена [60]. Подавляющее количество этих эндофитов, в том числе Rhizobium sp., который был выделен из Astragalus , являются грамотрицательными бактериями [59]. Исходя из этого, ожидается, что многие экстракты растений будут содержать ЛПС из-за лизиса этих бактериальных эндофитов.

Рис. 7. Концентрация эндотоксина в экстрактах растений.

Концентрации эндотоксина в перечисленных ботанических экстрактах измеряли с помощью модифицированного анализа лизата амебоцитов Limulus. Концентрации (единицы эндотоксина / мл; EU / мл) определяли путем сравнения со стандартным раствором Escherichia coli .Для Astragalus и Urtica несколько препаратов экстракта были приготовлены в разное время с использованием нескольких партий растительного материала, полученного от поставщика (образцы I – IV и образцы I – V, соответственно).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0012561.g007

Обсуждение

Целью этого исследования было получить более полное представление о регуляции экспрессии клеточных генов различными иммуностимулирующими травами. Поскольку личное использование и назначение общих растительных экстрактов резко возросло в последние годы, это исследование было направлено на измерение изменений в экспрессии генов цитокинов в клетках, обработанных полным растительным экстрактом.Даже несмотря на то, что эти анализы проводились в системе культивирования клеток, результаты могут помочь в понимании физиологических эффектов, которые, как считается, связаны с введением этих экстрактов людям. Введение этих травяных экстрактов людям обычно осуществляется перорально, что приводит к сублингвальному и кишечному захвату активных компонентов в кровоток. Неизвестно, изменяются ли эти компоненты в кишечной среде, однако сублингвальное введение позволяет прямую диффузию в кровоток.Попадая в кровоток, эти компоненты, вероятно, взаимодействуют с PBMC, что приводит к продукции цитокинов. Хотя многие исследования сосредоточены на выявлении ключевых активных компонентов, присутствующих в экстракте трав, это выходит за рамки настоящего исследования. Подтверждение и достоверность данных, полученных в результате исследований экспрессии микроматрицы, подтверждается нашими результатами, где (1) многие из генов с измененной экспрессией были обнаружены множеством наборов зондов, присутствующих на чипах микроматрицы, и продемонстрировали аналогичные уровни экспрессии между этими зондами (рис. 3), (2) многие гены с измененной экспрессией были аналогичным образом изменены разными травами, использованными в этом исследовании (рис. 3), (3) разные образцы клеток имели значительно схожий набор генов, измененных по экспрессии (рис. 5), (4) количественная ПЦР в реальном времени отобранных генов продемонстрировала аналогичные изменения в экспрессии генов, полученные в исследовании микроматрицы (таблица 1), и (5) только те гены с 3-кратным или большим коэффициентом ( P <0.01) изменения экспрессии были включены в наш анализ.

Астрагал является одним из основных продуктов традиционной китайской медицины, являясь одним из старейших лекарственных растений, перечисленных в материальной медицине китайской фитотерапии [61]. Китайские травники использовали Astragalus , чтобы предположительно помочь человеческому организму противостоять болезням [62]. Это наиболее часто используемое растение в китайской медицине. Современные травники используют Astragalus в первую очередь в качестве иммуностимулятора для предотвращения распространенной инфекции и помощи в выздоровлении после инфекции [62].Несколько исследований на животных и двойные слепые рандомизированные пилотные исследования на людях продемонстрировали влияние на продукцию цитокинов и активацию иммунных клеток после приема экстракта астрагала [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. Исторически биологическая активность, связанная с Astragalus , объяснялась, по крайней мере частично, несколькими составляющими, присутствующими в траве, включая флавоноиды, сапонины и полисахариды [61], [63].Наши данные показывают, что LPS, присутствующий в экстракте Astragalus , также может быть ключевым компонентом. Астрагал привел к индукции IL1alpha, IL1beta, IL6 и IL8, что, вероятно, приводит к раннему провоспалительному ответу. Эти провоспалительные цитокины, как известно, индуцируются ЛПС и активируются всеми тремя испытанными иммуностимулирующими травяными экстрактами [64]. Th2-специфические цитокины, IL2, TNFalpha и IFNgamma не были активированы ни в одном из образцов, и это может указывать на то, что может потребоваться присутствие инфекционного агента для дальнейшего стимулирования иммунного ответа.Неожиданно TNFalpha, который, как известно, индуцируется LPS, не был обнаружен после обработки Astragalus [64]. Это может указывать на то, что тип (ы) ЛПС, присутствующий в экстракте, не индуцирует TNF-альфа или что другие компоненты экстракта действуют, ингибируя индукцию TNF-альфа. Альтернативным объяснением может быть то, что LPS-индуцируемый регуляторный цитокин IL10, который был обнаружен в обоих образцах PBMC, действовал, подавляя или предотвращая индукцию IL2, TNF-альфа и IFN-гамма, которые могут иметь важное значение для защиты от некротического повреждения.Однако индукция альфа-цепи рецептора IL-2 наблюдалась в обоих образцах, что свидетельствует о готовности индуцировать ответ Th2 при появлении инфекции. Кроме того, Astragalus был описан как способный перенаправлять основной иммунный ответ Th3 на ответ Th2, как это наблюдается у пациентов с хронической вирусной инфекцией или раком [8], [37]. Наши данные микроматрицы подтверждают эту идею, поскольку мы наблюдали модуляцию множества генов, соответствующих профилю макрофагов M1-типа, которые активируются в наших PBMC [47].Способность Astragalus сдвигать иммунный ответ в сторону фенотипа Th2 подтверждается предыдущими исследованиями вирусной инфекции in vivo , которые требуют ответа Th2 для разрешения [8], [27], [29], [30].

На основании охарактеризованных функций и активности Astragalus , наши данные микрочипа согласуются с историческим использованием Astragalus и могут предоставить дополнительную информацию о том, как это растение может вызывать предполагаемые физиологические эффекты.Наряду с теми цитокинами, которые ранее были описаны как активируемые Astragalus, , мы обнаружили дополнительные цитокины, индуцируемые этой травой, многие из которых играют роль в хемотаксисе и экстравазации (например, CCL2, CCL7, CCL19, CCL20, CXCL1, CXCL5, CXCL6, CXCL13, рецепторы формилпептида 1 и 2, MMP1, MMP12 и муциноподобные 1). Некоторые из этих цитокинов могут быть индуцированы LPS в макрофагах здоровых пациентов (CCL19, CCL20, CXCL1, CXCL13, MMP1) и связаны с генами, реагирующими на NF-κB [65].Однако многие LPS-чувствительные гены с сайтами связывания NF-κB или без них не были индуцированы Astragalus , что предполагает альтернативные способы регуляции гена с помощью экстракта. Основываясь на наших данных, Astragalus , по-видимому, вызывает генерализованное и / или препаративное состояние в отношении стимуляции иммунного ответа, что согласуется с предполагаемыми физиологическими эффектами этого растения. Следует отметить, что индуцировались множественные MIP (воспалительные белки макрофагов), включая MIP-1α, MIP-1β, MIP-2α и MIP-2β (также называемые CCL3, CCL4, CXCL2, CXCL3 соответственно).CCL3, CCL4 и CXCL2, как известно, индуцируются LPS и могут указывать на роль этого компонента Astragalus в мобилизации полиморфно-ядерных лейкоцитов для врожденной защиты [65].

В дополнение к этим эффектам на иммунный ответ, Astragalus был описан как имеющий эффект на заживление ран и модуляцию артериального давления. Что касается роли Astragalus в заживлении ран, то ранее не было описано, что клеточные белки участвуют в этом физиологическом ответе.Недавно было показано, что экстракты Astragalus значительно ускоряют заживление кожных ран, стимулируя рост базальных клеток в области раны и способствуя ангиогенезу [38]. Из наших исследований микроматрицы было идентифицировано несколько предполагаемых белков, которые могут повлиять на заживление ран. К ним относятся адреномедуллин, фибронектин типа III и домен SPRY, содержащий 1-подобный гепарин-связывающий EGF-подобный фактор роста, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), гиалуронансинтазу 1, сфингозин-1-фосфатфосфатазу 2 и IL24.Кроме того, несколько индуцированных генов (эпирегулин, матриксная металлопептидаза 14, подпланин, VEGF, тромбоспондин-1) играют ключевую роль в ангиогенезе. Это согласуется с недавними сообщениями, которые предполагают, что Astragalus способствует ангиогенезу и индуцирует экспрессию VEGF [38], [66]. Неизвестно, что большинство вышеуказанных генов реагируют на LPS, за исключением VEGF и, возможно, сфингозин-1-фосфатфосфатазы 2, которые оба содержат сайты связывания NF-κB в своих промоторах [67], [68].Кроме того, известно, что ЛПС отрицательно влияет на заживление ран [69]. Это предполагает, что альтернативные компоненты Astragalus , вероятно, опосредуют заживление ран и ангиогенные эффекты и могут модулировать активность LPS. Что касается модуляции артериального давления, индуцировались простагландин-эндопероксидсинтаза 2 (COX-2), адреномедулин (ADM) и моноаминоксидаза, которые, как известно, участвуют в расширении сосудов. LPS индуцирует как COX-2, так и ADM и может быть активным компонентом, связанным с модуляцией артериального давления [65], [70].Было показано, что вазодепрессорная роль продукта гена ЦОГ-2 регулируется и зависит от активности и соотношения ЦОГ-1 и ЦОГ-2 [71]. Примечательно, что обработка PBMC экстрактом Astragalus приводила к высокой индукции транскрипции COX-2 при небольшом подавлении экспрессии гена COX-1, возможно, поддерживая вазодепрессорный эффект. Точно так же были индуцированы несколько белков, которые могут влиять на свертывание крови, включая фактор свертывания крови III, интегрин β3 и тромбомодулин, и не было показано, что эти гены индуцируются LPS.Интересно, что тромбомодулин может предотвращать индукцию LPS воспалительных молекул путем ингибирования передачи сигналов NF-kB [72]. Компоненты растений, а также естественное присутствие LPS в экстрактах Astragalus могут вместе быть ответственными за индукцию генов, участвующих в ангиогенезе, модуляции кровяного давления и свертывании крови [73], [74], [75]. Необходимы дальнейшие исследования для определения эффектов других компонентов, присутствующих в экстрактах Astragalus , которые могут модулировать активность LPS в предполагаемых физиологических функциях.

Экстракт Sambucus , как и Astragalus , в первую очередь назначают из-за его иммуномодулирующей, антиоксидантной и противовирусной активности. Ограниченные исследования с Sambucus продемонстрировали его способность значительно увеличивать продукцию IL1beta, IL6, IL8 и IL10 [24], [53]. Эти цитокины были аналогичным образом активированы в наших исследованиях на микроматрицах, как и многие другие цитокины. Что касается антиоксидантной активности, связанной с Sambucus , мы обнаружили, что супероксиддисмутаза 2 сильно индуцирована и может быть связана с этой активностью.И Sambucus , и Astragalus индуцировали очень похожий набор цитокинов и, как правило, с очень похожим уровнем индукции. Несмотря на то, что иммунологически активные компоненты Sambucus недостаточно охарактеризованы, вероятно, они включают флавоноиды и антоцианы [76], а также ЛПС, как определено в этом исследовании. Эти данные свидетельствуют о том, что эти расходящиеся травы оказывают схожее действие на иммунные клетки, хотя, возможно, через совершенно разные эффекторы.

Экстракт Andrographis традиционно использовался из-за его противораковой и иммуномодулирующей активности [55], [77].В наших результатах микроматрицы Andrographis индуцировал множество иммуностимулирующих генов, подобных Astragalus и Sambucus , но существенно отличался, как правило, с изменением экспрессии гораздо меньшего количества генов. Это может означать, что Andrographis действительно обладает иммуностимулирующей активностью, но влияние на иммунные клетки может быть значительно снижено или направлено на более специфический ответ. К сожалению, прямого сравнительного исследования между этими травами никогда не проводилось.Интересно, что Andrographis , как предполагалось, снижает артериальное давление [78], как и бактериальный LPS [79], и, как Astragalus , он приводит к индукции сосудорасширяющих средств, включая адреномедуллин и простагландин-эндопероксидсинтазу 2 (COX-2). .

Urtica обычно используется при ревматологических состояниях из-за его противовоспалительной и иммунодепрессивной активности [57]. В нашем исследовании это растение было эффективным в демонстрации того, что гены, индуцированные иммуностимулирующими травами, были специфичными, а не из-за воздействия какого-либо растительного экстракта на иммунные клетки.Обработка клеток экстрактом Urtica практически не приводила к изменениям экспрессии клеточных генов. Это подтверждает предыдущее клиническое исследование, в котором введение Urtica здоровому человеку не влияло на экспрессию генов цитокинов, включая TNF, IL1, IL4, IL6 и IL10 [32]. Однако после иммуностимуляции у этих субъектов Urtica смог снизить экспрессию этих цитокинов, и эта активность, вероятно, связана со способностью Urtica ингибировать активацию фактора транскрипции, NF-κB [80].

Уровень экспрессии — важный аспект действия гена. Понятно, что сниженная или повышенная экспрессия генов может влиять на многие количественные характеристики. Иммуностимулирующие травы могут изменять экспрессию подобных генов, но также могут оказывать резко различное влияние на физиологический ответ за счет значительных различий в уровнях экспрессии генов или специфических различий в регулируемых генах. . Многие растительные экстракты, в том числе и в этом исследовании, были использованы из-за их антимикробной активности [31].Хотя некоторая часть этой активности может быть связана с прямым антимикробным действием этих трав, большая часть этой активности может быть связана с иммуностимулирующей активностью, которую мы описали.

Лечение астрагалом привело к индукции специфических провоспалительных цитокинов на протяжении всего курса лечения (от 3 до 18 часов). Однако был также отчетливый временной ответ в экспрессии генов. Сразу после лечения многие из индуцированных генов участвовали в процессах передачи сигнала и модификации РНК / белка.После этого первоначального ответа индуцированные впоследствии гены в первую очередь участвовали в усилении воспалительного ответа. Этот тип временной воспалительной реакции ранее наблюдался у мышей, получавших иммуностимуляторы. Хан, и др. . обнаружили, что иммуно-стимулы приводят к ранней индукции нескольких генов, включая цитокины, что впоследствии приводит к вторичной индукции экспрессии генов. Считается, что этот тип временной активации, хотя и не полностью изучен, связан с усилением, сохранением и устойчивостью воспалительных процессов [81].Этот тип ответа соответствует физиологической активности, для которой используется Astragalus .

Ранее было описано, что значительные естественные вариации в уровнях экспрессии генов существуют внутри и среди человеческих популяций [49]. В нашем исследовании с использованием PBMC от двух совершенно разных людей, более 30% генов, индуцированных Astragalus , обычно изменялись в экспрессии. Основываясь на генетическом разнообразии, этот уровень сходства был заметным и, вероятно, представляет те гены, которые характерно индуцируются Astragalus в иммунных клетках.Как и ожидалось, многие из этих консервативных генов участвуют в провоспалительном ответе, а также в заживлении ран, снижении артериального давления и повышении риска кровотечения (включая различные цитокины и интерлейкины, гиалуронансинтазу 1, сфингозин-1-фосфатазу 2, тромбомодулин, эпирегулин, моноаминоксидаза, простагландин-эндопероксидсинтаза 2 [ЦОГ-2]). Как и ожидалось с человеческим разнообразием, каждый отдельный образец также индуцировал определенный набор генов. Подавляющее большинство этих генов участвуют в иммунной / воспалительной реакции и, вероятно, представляют индивидуальную реакцию на растительные иммунные стимулы.Например, PBMC от одного человека индуцировали высокие уровни семейства генов колониестимулирующих факторов (CSF1, CSF2 и CSF3) после обработки Astragalus. Эти гены не были изменены в экспрессии в другом наборе PBMC. Учитывая, что эти CSF помогают стимулировать производство различных лейкоцитов, они являются ключевыми факторами провоспалительного ответа. Поскольку эти гены были экспрессированы индивидуально, они, вероятно, влияют на индивидуальную чувствительность и эффективность к Astragalus в отношении иммунного ответа.

Как уже упоминалось, все экстракты, использованные в этом исследовании, репрезентативны тем же, что и экстракты, которые регулярно прописываются пациентам лицензированными врачами в области дополнительной и альтернативной медицины. Было обнаружено, что при испытании четырех различных иммуностимулирующих трав ( Astragalus, Sambucus, Andrographis, и Echinacea ) в экстракте присутствуют относительно высокие уровни ЛПС. Важно отметить, что гораздо более низкие уровни ЛПС были обнаружены в экстрактах трав, которые исторически использовались для подавления иммунитета ( Urtica и Tylophora ).Наши данные подтверждают, что этот LPS не был вызван загрязнением во время сбора урожая, обработки или приготовления экстракта, а был вызван симбиотическими эндофитными бактериями, присутствующими в растениях. Поскольку огромное количество ботанических эндофитных бактерий являются грамотрицательными [59], ЛПС, присутствующий в экстрактах, вероятно, был получен путем лизиса этих бактериальных клеток. Хотя идентификация активных компонентов, присутствующих в этих ботанических экстрактах, не была целью этого исследования, наши данные подтверждают роль ЛПС в регуляции иммунологического ответа.Будущие исследования будут сосредоточены на расшифровке конкретных типов и роли ЛПС в этих клеточных ответах.

Все экстракты, использованные в этом исследовании, были приготовлены Herbal Vitality, Inc. (Седона, Аризона, США). Эта компания была выбрана, поскольку они являются источником растительных продуктов, используемых лицензированными практиками в этой области. Эта компания обеспечивает идентификацию всех видов растений и готовит высокоактивные и воспроизводимые растительные экстракты в соответствии с традиционными и принятыми методами экстракции, используемыми в области дополнительной и альтернативной медицины.Это важный аспект данного исследования, поскольку все экстракты, использованные в этом исследовании, репрезентативно такие же, как и экстракты, регулярно прописываемые пациентам лицензированными врачами. Предыдущие исследования иммуностимулирующих трав обычно были сосредоточены на очистке активных компонентов, свободных от эндотоксинов. Для этого исследования мы хотели оценить клеточный ответ на иммуностимулирующие растительные экстракты в контексте экстрактов, характерных для тех, которые прописаны пациентам. Поскольку многие из этих предписанных иммуностимулирующих экстрактов, по-видимому, содержат ЛПС, вероятно, в результате лизиса эндофитных бактерий, это исследование представляет собой более физиологически релевантное исследование для изучения потенциального клеточного ответа после воздействия целого растительного экстракта.

Как упоминалось выше, было показано, что различные компоненты этих иммуностимулирующих трав играют иммуностимулирующую роль и действуют, вызывая экспрессию цитокинов. Основываясь на известной роли LPS, ожидается, что LPS, присутствующий в этих экстрактах, также влияет на экспрессию иммунных генов. Ожидалось, что цитокины, ИЛ-альфа, ИЛ-бета, ИЛ6 и ИЛ10 будут индуцироваться ЛПС, однако мы не наблюдали индукции других типично индуцируемых цитокинов, таких как TNF-альфа или МСР-2. Однако структура и активность ЛПС сильно различаются у разных бактерий, а структуры ЛПС у эндофитных бактерий не были хорошо охарактеризованы [50].Действительно, Rhizobium sp. Было показано, что устанавливает симбиотические отношения с корнями Astragalus [82], [83]. В отличие от ЛПС, полученного из энтеробактерий, который активирует иммунные клетки через трансмембранный Toll-подобный рецептор 4 (TLR4), структурно отличный от LPS из Rhizobium действует через TLR2 и TLR6 [50], [51], [82]. Хотя считается, что TLR2 и TLR6 одинаково участвуют в стимуляции иммунных клеток, профили экспрессии генов и клеточный ответ могут отличаться от активации посредством TLR4.Эндофитные бактерии были идентифицированы в тканях всех известных живых растений [58], [59], [60]. Поскольку растительные экстракты веками использовались людьми для лечения различных заболеваний, компоненты этих бактерий могут быть вовлечены в историческую деятельность, связанную с этими травами. Недавние исследования подтверждают, что ботанические эндофитные микробы синтезируют активные противовирусные, противораковые, антиоксидантные и иммунодепрессивные соединения [58]. ЛПС этих бактерий может представлять собой еще одну активную группу соединений, участвующих в активности этих трав.Дальнейшие исследования будут сосредоточены на выделении и характеристике ЛПС эндофитных бактерий, а также на определении специфической роли в регуляции экспрессии генов и воспалительной реакции.

В заключение, хотя микроматричный анализ не дает убедительных доказательств того, что гены, индуцированные иммуностимулирующими травами, ответственны за физиологические эффекты, наблюдаемые у людей после введения различных трав, он дает представление о предполагаемых генах и направлениях будущих исследований.Следует отметить, что многие травы, в том числе Astragalus , обычно считаются безопасными даже при высоких дозах и длительном применении [84]. Наши данные подтверждают, что лечение Astragalus индуцировало гены, участвующие в сильном генерализованном провоспалительном ответе. Этот иммунный ответ может быть ответственным за большую часть антимикробной активности, связанной с Astragalus. Однако следует соблюдать осторожность и проводить дальнейшие исследования в отношении длительного непрерывного использования некоторых трав, таких как Astragalus , которые могут привести к физиологическим эффектам, связанным с устойчивой воспалительной активностью.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: RFW BJ JL. Проведены эксперименты: KLD JL. Проанализированы данные: KLD RFW BJ YR JL. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: YR. Написал статью: KLD JL.

Список литературы

1. Астин Дж. (1998) Почему пациенты используют альтернативную медицину: результаты национального исследования. JAMA 279: 1548–1553.
2. Фишер П., Уорд А. (1994) Дополнительная медицина в Европе.BMJ 309: 107–111.
3. Barnes PM, Powell-Griner E, McFann K, Nahin RL (2004) Использование дополнительной и альтернативной медицины среди взрослых: Соединенные Штаты, 2002. Adv Data 343: 1–19.
4. Ричи (2007) Использование травяных добавок и пищевых добавок в Великобритании: что мы знаем об их использовании? Proc Nutr Soc 66: 479–482.
5. Fu PP, Chiang HM, Xia Q, Chen T, Chen BH и др. (2009) Обеспечение качества и безопасности пищевых добавок на травах.J Environ Sci Health C Environ Carcinog Ecotoxicol Rev 27: 91–119.
6. Thomas KJ, Nicholl JP, Coleman P (2001) Использование и расходы на дополнительную медицину в Англии: обследование населения. Дополнение Ther Med 9: 2–11.
7. Айзенберг Д.М., Дэвис Р.Б., Эттнер С.Л., Аппель С., Уилки С. и др. (1998) Тенденции использования альтернативной медицины в Соединенных Штатах, 1990–1997 годы: результаты последующего национального исследования. JAMA 280: 1569–1575.
8. Мао С.П., Ченг К.Л., Чжоу Ю.Ф. (2004) Модулирующее влияние астрагала перепончатого на цитокин Th2 / Th3 у пациентов с кератитом простого герпеса.Чжунго Чжун Си И Цзе Хе За Чжи 24: 121–123.
9. Cho WC, Leung KN (2007) Противоопухолевые эффекты Astragalusmbranaceus in vitro и in vivo. Cancer Lett 252: 43–54.
10. Brush J, Mendenhall E, Guggenheim A, Chan T, Connelly E, et al. (2006) Эффект Echinacea purpurea, Astragalusmbranaceus и Glycyrrhiza glabra на экспрессию CD69 и активацию иммунных клеток у людей. Phytother Res 20: 687–695.
11. Zwickey H, Brush J, Iacullo CM, Connelly E, Gregory WL и др.(2007) Эффект Echinacea purpurea, Astragalusmbranaceus и Glycyrrhiza glabra на экспрессию CD25 у людей: пилотное исследование. Phytother Res 21: 1109–1112.
12. Ван Ф, Сяо, доктор медицины, Ляо Б. (2008) Влияние астрагала на цитокины у пациентов, перенесших замену сердечного клапана. Чжунго Чжун Си И Цзе Хе За Чжи 28:
13. Маткович З., Живкович В., Корица М., Плавец Д., Пеканик С. и др. (2010) Эффективность и безопасность астрагала перепончатого в лечении пациентов с сезонным аллергическим ринитом.Phytother Res 24: 175–181.
14. Cho WC, Leung KN (2007) In vitro и in vivo иммуномодулирующие и иммуно-восстановительные эффекты Astragalusmbranaceus. Дж. Этнофармакол 113: 132–141.
15. Ragupathi G, Yeung KS, Leung PC, Lee M, Lau CB и др. (2008) Оценка широко потребляемых растительных препаратов в качестве иммунологических адъювантов. Вакцина 26: 4860–4865.
16. Zhu XL, Zhu BD (2007) Механизмы, с помощью которых инъекция Astragalusmbranaceus регулирует гематопоэз у мышей с подавленным миелозом.Phytother Res 21: 663–667.
17. Инь X, Чен Л., Лю И, Ян Дж., Ма С. и др. (2010) Усиление врожденного иммунного ответа эпителиальных клеток мочевого пузыря полисахаридами астрагала посредством усиления экспрессии TLR4. Biochem Biophys Res Commun.
18. Ян X, Хуанг С., Чен Дж., Сонг Н., Ван Л. и др. (2010) Оценка адъювантных свойств Astragalusmbranaceus и Scutellaria baicalensis GEORGI в иммунной защите, вызванной УФ-ослабленной Toxoplasma gondii на моделях мышей.Vaccine 28: 737–743.
19. Чен В., Ли Ю. М., Ю. М. Х. (2008) Полисахариды астрагала: эффективное лечение диабета у мышей NOD. Exp Clin Endocrinol Diabetes 116: 468–474.
20. Кан И (2008) Гербогеномика: от традиционной китайской медицины до новых терапевтических средств. Exp Biol Med (Maywood) 233: 1059–1065.
21. Спелман К., Бернс Дж., Николс Д., Винтерс Н., Оттерсберг С. и др. (2006) Модуляция экспрессии цитокинов традиционными лекарствами: обзор иммуномодуляторов трав.Альтернативная медицина Rev 11: 128–150.
22. Fontanarosa PB, Lundberg GD (1998) Альтернативная медицина встречает науку. JAMA 280: 1618–1619.
23. Флеминг Л.В. (1999) Лечебный букет. Маки, хина и ива. Scott Med J 44: 176–179.
24. Барак В., Биркенфельд С., Гальперин Т., Каликман И. (2004) Влияние лечебных трав на производство воспалительных и противовоспалительных цитокинов человека. Isr Med Assoc J 4: 919–922.
25.Бергнер П. (2005) Антивирусные ботанические препараты в фитотерапии. Med Herbalism 14: 1–12.
26. Хун Х, редактор. (1986) Oriental Materia Medica: краткое руководство. Лонг-Бич, Калифорния.
27. Peng T, Yang Y, Riesemann H, Kandolf R (1995) Ингибирующее действие астрагала перепончатого на репликацию РНК вируса Коксаки B-3. Chin Med Sci J 10: 146–150.
28. Sun Y, Yang J (2004) Экспериментальное исследование эффекта Astragalusmbranaceus против вируса простого герпеса 1 типа.Ди И Цзюнь Йи Да Сюэ Сюэ Бао 24: 57–58.
29. Kusum M, Klinbuaayaem V, Bunjob M, Sangkitporn S (2004) Предварительная эффективность и безопасность пероральной суспензии SH, комбинации пяти китайских лекарственных трав, у людей, живущих с ВИЧ / СПИДом: исследование фазы I / II. J Med Assoc Thai 87: 1065–1070.
30. Liu JP, Yang M, Du XM (2004) Травяные лекарства от вирусного миокардита. Кокрановская база данных Syst Rev 3: 3711.
31. Мартин К.В., Эрнст Э. (2003) Противовирусные агенты из растений и трав: систематический обзор.Антивир Тер 8: 77–90.
32. Teucher T, Obertreis B, Ruttkowski T, Schmitz H (1996) Секреция цитокинов в цельной крови здоровых субъектов после перорального введения экстракта растения Urtica dioica L. Arzneimittelforschung 46: 906–910.
33. Langland JO, Kash JC, Carter V, Thomas MJ, Katze MG и др. (2006) Подавление передачи провоспалительного сигнала и экспрессии генов двойными доменами связывания нуклеиновых кислот белков E3L вируса осповакцины.Дж. Вирол 80: 10083–10095.
34. Shon YH, Kim HJ, Nam KS (2002) Эффект экстракта корня астрагали на вызванное липополисахаридом воспаление в амнионе человека. Биол Фарм Булл 25: 77–80.
35. Yesilada E, Bedir E, Caliş I, Takaishi Y, Ohmoto Y (2005) Влияние тритерпеновых сапонинов из видов Astragalus на высвобождение цитокинов in vitro. J Ethnopharmacol 96: 71–77.
36. Дун Дж., Гу Х.Л., Ма CT, Чжан Ф., Чен Зи и др. (2005) [Влияние большой дозы Astragalusmbranaceus на индукцию дендритными клетками периферических мононуклеарных клеток и антигенпредставляющую способность дендритных клеток у детей с острым лейкозом].Чжунго Чжун Си И Цзе Хе За Чжи 25: 872–875.
37. Вэй Х, Сунь Р., Сяо В., Фэн Дж., Чжэнь С. и др. (2003) Традиционная китайская медицина Астрагал обращает вспять преобладание цитокинов Th3 и их вышестоящих транскрипционных факторов у пациентов с раком легких. Онкол Реп 10: 1507–1512.
38. Han DO, Lee HJ, Hahm DH (2009) Ранозаживляющая активность корня астрагали у крыс. Методы Найдите Exp Clin Pharmacol 31: 95–100.
39. Хикино Х, Фунаяма С., Эндо К. (1976) Гипотензивный принцип корней астрагала и Hedysarum.Planta Med 30: 297–302.
40. Dong TT, Zhao KJ, Gao QT, Ji ZN, Zhu TT и др. (2006) Химическая и биологическая оценка китайского травяного отвара, содержащего Radix Astragali и Radix Angelicae Sinensis: определение соотношения лекарств для получения оптимальных свойств. J. Agric Food Chem., 54: 2767–2774.
41. Гессани С., Теста Ю., Варано Б., ДиМарцио П., Борги П. и др. (1993) Повышенная продукция цитокинов, индуцированных ЛПС, во время дифференцировки человеческих моноктов в макрофаги.J Immunol 151: 3758–3766.
42. Mietus-Snyder M, Glass CK, Pitas RE (1998) Транскрипционная активация экспрессии рецептора скавенджера в гладкомышечных клетках человека требует AP-1 / c-Jun и C / EBPbeta: как связывание AP-1, так и активация JNK индуцируются сложными эфирами форбола и оксидативный стресс. Артериосклер Thromb Vasc Biol 18: 1440–1449.
43. Chomarat P, Banchereau J, Davoust J, Palucka AK (2000) IL-6 переключает дифференцировку моноцитов с дендритных клеток на макрофаги.Nat Immunol 1: 510–514.
44. Lee KY, Jeon YJ (2005) Активация макрофагов полисахаридом, выделенным из Astragalusmbranaceus. Int Immunopharmacol 5: 1225–1233.
45. Moeenrezakhanlou A, Shephard L, Lam L, Reiner NE (2008) Дифференцировка миелоидных клеток в ответ на кальцитриол для экспрессии CD11b и CD14 регулируется миелоидным белком цинкового пальца-1 ниже фосфатидилинозитол-3-киназы. J Leukoc Biol 84: 519–528.
46.Hmama Z, Knutson KL, Herrera-Velit P, Nandan D, Reiner NE (1999) Прилипание моноцитов, индуцированное липополисахаридом, включает CD14, LFA-1 и цитогезин-1. Регулирование Rho и фосфатидилинозитол 3-киназой. J Biol Chem 274: 1050–1057.
47. Мартинес Ф.О., Гордон С., Локати М., Мантовани А. (2006) Транскрипционное профилирование дифференцировки и поляризации человеческих моноцитов и макрофагов: новые молекулы и паттерны экспрессии генов. J Immunol 177: 7303–7311.
48.Barrios-Rodiles M, Chadee K (1998) Новое регулирование экспрессии циклооксигеназы-2 и продукции простагландина E2 с помощью IFN-гамма в макрофагах человека. J Immunol 161: 2441–2448.
49. Storey JD, Madeoy J, Strout JL, Wurfel M, Ronald J, Akey JM (2007) Вариации экспрессии генов внутри и среди человеческих популяций. Am J Hum Genet 80: 502–509.
50. Caroff M, Karibian D, Cavaillon JM, Haeffner-Cavaillon N (2002) Структурные и функциональные анализы бактериальных липополисахаридов.Микробы заражают 4: 915–926.
51. Фройденберг М.А., Чаптчет С., Кек С., Фейер Г., Хубер М. и др. (2008) Чувствительность липополисахаридов как важный фактор врожденного иммунного ответа на грамотрицательные бактериальные инфекции: преимущества и опасности гиперчувствительности к ЛПС. Иммунобиология 213: 193–203.
52. Нос М., Тераваки К., Огури К., Огихара Ю., Йошимацу К. и др. (1998) Активация макрофагов фракциями сырых полисахаридов, полученных из побегов Glycyrrhiza glabra и волосатых корней Glycyrrhiza uralensis in vitro.Биол Фарм Булл 21: 1110–1112.
53. Барак В., Гальперин Т., Каликман И. (2001) Влияние Самбукола, натурального продукта на основе черной бузины, на производство цитокинов человека: I. Воспалительные цитокины. Eur Cytokine Netw 12: 290–296.
54. Блок К.И., Мид М.Н. (2003) Эффекты эхинацеи, женьшеня и астрагала на иммунную систему: обзор. Integr Cancer Ther 2: 247–267.
55. Кумар Р.А., Шридеви К., Кумар Н.В., Нандури С., Раджагопал С. (2004) Противораковые и иммуностимулирующие соединения из Andrographis paniculata.Дж. Этнофармакол 92: 291–295.
56. Ganguly T, Sainis KB (2001) Ингибирование клеточных иммунных ответов Tylophora indica в экспериментальных моделях. Фитомедицина 8: 348–355.
57. Setty AR, Sigal LH (2005) Растительные препараты, обычно используемые в практике ревматологии: механизмы действия, эффективность и побочные эффекты. Semin Arthritis Rheum 34: 773–784.
58. Strobel G, Daisy B (2003) Биоразведка микробных эндофитов и их натуральных продуктов.Microbiol Mol Biol Rev 2003 Dec; 67 (4): 491-502 67: 491-502.
59. Розенблют М., Мартинес-Ромеро Э. (2006) Бактериальные эндофиты и их взаимодействия с хозяевами. Взаимодействие микробов растений Mol 19: 827–837.
60. Райан Р.П., Жермен К., Фрэнкс А., Райан Д. Д., Доулинг Д. Н. (2008) Бактериальные эндофиты: последние разработки и применения. FEMS Microbiol Lett 278: 1–9.
61. Sinclair (1998) Китайские травы: клинический обзор Astragalus, Ligusticum и Schizandrae.Альтернативная медицина Rev 3: 338–344.
62. Тан Б.К., Ванита Дж. (2004) Иммуномодулирующие и антимикробные эффекты некоторых традиционных китайских лекарственных трав: обзор. Curr Med Chem 11: 1423–1430.
63. Риос Дж. Л., Уотерман П. Г. (1997) Обзор фармакологии и токсикологии астрагала. Phytother Res 411–418.
64. Guha M, Mackman N (2001) Индукция экспрессии генов LPS в человеческих моноцитах. Cell Signal 13: 85–94.
65.Шариф О., Большаков В. Н., Рейнс С., Ньюхэм П., Перкинс Н. Д. (2007) Транскрипционное профилирование LPS-индуцированного ответа NF-kappaB в макрофагах. BMC Immunol 8: 1.
66. Lei Y, Wang JH, Chen KJ (2003) Сравнительное исследование эффекта ангиогенеза Astragalusmbranaceus и Angelica sinensis в хориоллантоисной мембране куриного эмбриона. Чжунго Чжун Яо За Чжи 28: 876–878.
67. Ramanathan M, Pinhal-Enfield G, Hao I, Leibovich SJ (2007) Синергетическая повышающая регуляция экспрессии фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) в макрофагах агонистами рецептора аденозина A2A, а эндотоксин включает регуляцию транскрипции через элемент ответа на гипоксию в промоторе VEGF .Mol Biol Cell 18: 14–23.
68. Мечтчерякова Д., Влахос А., Собанов Дж., Копп Т., Реушель Р. и др. (2007) Сфингозин-1-фосфатфосфатаза 2 индуцируется во время воспалительных реакций. Cell Signal 19: 748–760.
69. Кавагути Х., Хизута А., Танака Н., Орита К. (1995) Роль эндотоксина в ухудшении заживления ран. Res Commun Mol Pathol Pharmacol 89: 317–327.
70. Zaks-Zilberman M, Salkowski CA, Elsasser T, Cuttitta F, Vogel SN (1998) Индукция мРНК и белка адреномедуллина липополисахаридом и паклитакселом (Таксолом) в мышиных макрофагах.Infect Immun 66: 4669–4675.
71. Qi Z, Cai H, Morrow JD, Breyer MD (2006) Дифференциация простаноидов, производных циклооксигеназы 1 и 2, в почках и аорте мышей. Гипертония 48: 323–328.
72. Shi CS, Shi GY, Hsiao SM, Kao YC, Kuo KL, et al. (2008) Лектин-подобный домен тромбомодулина связывается со своим специфическим лигандом Lewis Y-антигеном и нейтрализует вызванный липополисахаридом воспалительный ответ. Кровь 112: 3661–3670.
73. Поллет I, Опина С.Дж., Циммерман С., Леонг К.Г., Вонг Ф. и др.(2003) Бактериальный липополисахарид непосредственно индуцирует ангиогенез посредством TRAF6-опосредованной активации NF-kappaB и N-концевой киназы c-Jun. Кровь 102: 1740–1742.
74. Безугла Ю., Колада А., Камионка С., Бернар Б., Шайбе Р. и др. (2006) ЦОГ-1 и ЦОГ-2 по-разному способствуют LPS-индуцированному высвобождению PGE2 и TxA2 в макрофагах печени. Простагландины Другие липидные средства 79: 93–100.
75. Pernerstorfer T, Hollenstein U, Hansen J, Knechtelsdorfer M, Stohlawetz P и др.(1999) Гепарин подавляет активацию свертывания крови, вызванную эндотоксином. Тираж 100: 2485–2490.
76. Торн (2005) Монография. Sambucus nigra (бузина). Альтернативная медицина Rev 10: 51–54.
77. Пури А., Саксена Р., Саксена Р.П., Саксена К.С., Шривастава В. и др. (1993) Иммуностимуляторы из Andrographis paniculata. J Nat Prod 56: 995–999.
78. Zhao HY, Fang WY (1991) Антитромботические эффекты Andrographis paniculata nees в предотвращении инфаркта миокарда.Chin Med J (англ.) 104: 770–775.
79. Hallemeesch MM, Janssen BJ, de Jonge WJ, Soeters PB, Lamers WH, et al. (2003) Продукция NO cNOS и iNOS отражает изменения артериального давления у мышей, зараженных LPS. Am J Physiol Endocrinol Metab 285: E871–875.
80. Riehemann K, Behnke B, Schulze-Osthoff K (1999) Экстракты растений из крапивы двудомной (Urtica dioica), противоревматического средства, ингибируют провоспалительный фактор транскрипции NF-kappaB. FEBS Lett 442: 89–94.
81. Хан С.Дж., Ко Х.М., Чой Дж. Х., Со К. Х., Ли Х. С. и др. (2002) Молекулярные механизмы индуцированной липополисахаридом двухфазной активации ядерного фактора-каппа B (NF-kappa B.J Biol Chem 277: 44715–44721.
82. Жирар Р., Педрон Т., Уэмацу С., Баллой В., Чиньярд М. и др. (2003) Липополисахариды из Legionella и Rhizobium стимулируют гранулоциты костного мозга мышей через Toll-подобный рецептор 2. J Cell Sci 116: 293–302.
83. Wei GH, Tan ZY, Zhu ME, Wang ET, Han SZ, et al.(2003) Характеристика ризобий, выделенных из видов бобовых в пределах родов Astragalus и Lespedeza, произрастающих на Лессовом плато Китая, и описание Rhizobium loessense sp. ноя Int J Syst Evol Microbiol 53: 1575–1583.
84. Yu SY, Ouyang HT, Yang JY, Huang XL, Yang T и др. (2007) Исследования субхронической токсичности экстракта Radix Astragali у крыс и собак. Дж. Этнофармакол 110: 352–355.

Иммуностимулирующая активность экстрагируемых водой полисахаридов из Cistanche deserticola в качестве растительного адъюванта in vitro и in vivo

Abstract

Безопасный и эффективный вакцинный адъювант важен для современных вакцин.Различные полисахариды китайских трав могут активировать иммунную систему. Cistanche deserticola (CD) — традиционное китайское растение и кандидат в адъюванты. Здесь мы подтвердили, что экстрагируемые водой полисахариды CD (WPCD) могут модулировать иммунные ответы in vitro и in vivo . Дозозависимым образом WPCD значительно способствовал созреванию и функционированию дендритных клеток, полученных из костного мозга мыши (BM-DC), посредством повышающей регуляции уровней экспрессии MHC-II, CD86, CD80 и CD40, пролиферации аллогенных Т-клеток, и выходы IL-12 и TNF-α через toll-подобный рецептор4 (TLR4), как указано в экспериментах in vitro .Кроме того, его иммуномодулирующая активность также наблюдалась у мышей. WPCD эффективно улучшал титры IgG, IgG ₁ и IgG _2a и заметно усиливал пролиферацию Т- и В-клеток, продукцию IFN-γ и IL-4 в CD4 ⁺ Т-клетках и уровень экспрессии IFN-γ в CD8 ⁺ Т-лимфоцитах лучше, чем квасцы. Кроме того, WPCD может заметно повышать уровни экспрессии CD40 и CD80 на DC в селезенке и понижать частоту Treg. Исследование предполагает, что полисахариды Cistanche deserticola являются безопасным и эффективным адъювантом вакцины для индукции как гуморального иммунитета, так и клеточного иммунитета путем активации DC через сигнальный путь TLR4.

Образец цитирования: Zhang A, Yang X, Li Q, Yang Y, Zhao G, Wang B, et al. (2018) Иммуностимулирующая активность экстрагируемых водой полисахаридов из Cistanche deserticola в качестве растительного адъюванта in vitro и in vivo . PLoS ONE 13 (1): e01. https://doi.org/10.1371/journal.pone.01

Редактор: Сайед Фейсал, Национальный институт биотехнологии животных, ИНДИЯ

Поступила: 11 августа 2017 г .; Принята к печати: 3 января 2018 г .; Опубликован: 23 января 2018 г.

Авторские права: © 2018 Zhang et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе.

Финансирование: Работа поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (31660259, 31360224).

Конкурирующие интересы: Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Введение

Вакцины важны для контроля или предотвращения болезней. Недавно созданные и разрабатываемые вакцины представляют собой высокоочищенные рекомбинантные антигены с более высокой безопасностью, но очищенные антигены не могут стимулировать удовлетворительный иммунный ответ по сравнению с препаратами ослабленных или инактивированных патогенов. С помощью адъювантов вакцины могут вызывать стойкие иммунные ответы [1,2]. Новые мощные адъюванты широко используются как для разработки вакцин, так и для здоровья человека.На сегодняшний день идентифицированы и всесторонне изучены различные адъюванты. Эти адъюванты наделяют вакцины рядом преимуществ, включая уменьшение необходимого количества антигенов, минимизацию количества иммунизаций, необходимых для нормального иммунного ответа, и индукцию более быстрых, широких и сильных иммунных ответов [3–5]. Хотя было разработано много эффективных адъювантов, таких как липолисахарид (LPS) и полный адъювант Фрейнда (FCA), они не получили широкого распространения из-за их токсичности.Следовательно, только несколько адъювантов, таких как Alum, лицензированы для клинического использования [6]. В целом, необходимо разработать более эффективные и безопасные адъюванты для продвижения лучших профилактических и терапевтических вакцин против инфекционных и неинфекционных заболеваний.

Безопасность является важным фактором при разработке адъювантов. Компоненты китайских трав включают питательные вещества и важные активные композиты, такие как фенольные соединения и полисахариды, которые могут действовать как мощные иммуностимуляторы [7–9].Среди них широко исследовались полисахариды из традиционных китайских трав из-за их иммуностимулирующей активности и низкой токсичности. Например, инулин является иммунным адъювантом без токсичности других адъювантов, таких как FCA. Адъювант с дельта-инулином Advax ^TM также успешно повысил иммуногенность вакцины [10,11]. Астрагал, также известный как Huangqi на китайском языке и Radix Astragali на латинском языке, широко распространен по всему миру. Полисахарид является одним из его основных активных ингредиентов, отвечающих за иммуномодулирующую активность.Экспериментальные исследования показали, что полисахарид астрагала обладает сильным иммуномодулирующим действием как in vitro , так и in vivo [12, 13]. Полисахариды Lycium barbarum в качестве адъюванта вакцины также показали хорошие улучшения и стимулирующие эффекты [14, 15]. Эти исследования показали, что китайские травяные полисахариды были идеальными кандидатами для разработки адъювантов.

Cistanche deserticola Y . С . Ma (CD, «Ро Конг Ронг» по-китайски) — ценная традиционная китайская трава, которую часто называют «Женьшенем пустыни» из-за ее превосходных тонизирующих эффектов.Распространен в засушливых или полузасушливых регионах Синьцзяна. В Китае сушеный мясистый стебель использовался в качестве тонизирующего средства на протяжении сотен лет [16, 17]. В течение многих лет вареный ЦД использовался как тонизирующее средство для лечения нарушений, вызванных перенапряжением, что позволяет предположить, что он безопасен для перорального приема. Это растение широко известно из-за его широких лечебных функций. Недавние фитохимические и фармакологические исследования показали, что полисахариды являются основными биологически активными компонентами и обладают различными биологическими эффектами, включая иммуномодулирующую активность, антиоксидантное действие и противовоспалительное действие [18–21].Однако активность по усилению иммунитета экстрагируемых водой полисахаридов из C . deserticola в Синьцзяне редко регистрировались.

Хорошо известно, что DC являются важными антигенпрезентирующими клетками (APC), обеспечивающими сигналы, необходимые для инициирования иммунных ответов и модуляции врожденных и адаптивных клеток. Некоторые адъюванты, улучшающие захват антигена DC, могут увеличивать костимуляторные молекулы или молекулы MHC и повышать иммунитет. Когда начинается созревание ДК, продуцируется больше костимулирующих молекул и цитокинов, и ДК проявляют различные фенотипы [22, 23].

В этом исследовании мы сначала исследовали, может ли WPCD способствовать активации DCs посредством пути передачи сигналов TLR4 in vivo . Поскольку DC были связующим звеном между врожденным и адаптивным иммунными ответами, мы предположили, что активация DC, стимулированная WPCD, будет влиять на результат адаптивного иммунитета. Мы исследовали специфический иммунный ответ на овальбумин (OVA) у мышей, получавших WPCD, включая титры IgG, IgG ₁ и IgG _{2a подкласса}, пролиферацию T и B и продукцию цитокинов.Мы исследовали, повысит ли лечение WPCD активность DC и Treg-клеток в селезенке этих мышей. Наши результаты доказали потенциальную иммуномодулирующую активность природных полисахаридов из C . deserticola и расширил сферу его применения.

Материалы и методы

Животные

Самки мышей C57BL / 6, BALB / c или ICR в возрасте восьми-десяти недель были приобретены в Первой больнице Синьцзянского медицинского университета (Уримуци, Синьцзян, Китай).Мышей содержали в условиях, свободных от патогенов, в соответствии с руководящими принципами Комитета по уходу и использованию животных (ACUC) Синьцзянского университета здоровья и благополучия животных. Процедуры экспериментов на животных были одобрены AUCC Синьцзянского университета.

Экстракция водных экстрактов

С . deserticola — растение в провинции Синьцзян в Китае. Неочищенный полисахарид получали путем экстракции водой и осаждения этанолом. Вкратце, 100 г сушеного C . deserticola измельчали в порошок и затем фильтровали. Порошок повторно кипятили с петролейным эфиром при комнатной температуре, а затем кипятили с обратным холодильником с безводным этанолом в течение 1 ч для удаления окрашенных ингредиентов и липидов. Остатки экстрагировали кипящей водой трижды, экстракты объединяли, центрифугировали при 4000 об / мин в течение 10 минут и кипятили с обратным холодильником при 60 ° C в течение 4 часов. В раствор добавляли четырехкратный объем 95% этанола для осаждения сырых полисахаридов.Неочищенные полисахариды повторно растворяли в дистиллированной воде и обрабатывали реагентом Севаджа для удаления белков. Экстракты растворяли в PBS и стерилизовали через фильтр 0,22 мкм. Наконец, общее содержание сахара в WPCD составило 59,58%, как показал анализ фенол-серной кислоты [24].

Генерация РЦ

BM-DC были сгенерированы согласно ранее описанному методу с небольшими изменениями [25]. DC костного мозга мышей C57BL / 6 промывали полной средой RPMI-1640 (Gibco) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (Hyclone).Собранные клетки ресуспендировали в среде RPMI-1640 с 50 мкМ β-меркаптоэтанола (Sigma, St Louis, MO) и 20 нг / мл мышиного GM-CSF (Peprotech, Rocky Hill, NY) и инкубировали при 37 ° C в 5% CO ₂ атмосфера. Половину культуральной среды заменяли свежей средой, содержащей GM-CSF, каждые 1-2 дня. Клетки собирали на 6 день, обрабатывали различными дозами WPCD, LPS (100 нг / мл) (Sigma, St Louis, MO) в течение 24 часов, а затем оценивали с помощью проточной цитометрии.

Обнаружение созревания ДК и активации Т-клеток

in vitro

In vitro Эффект созревания WPCD на BM-DC оценивали на основании результатов фенотипического анализа с помощью FAC.На 7-й день BM-DC из C57BL / 6 индуцировали в присутствии GM-CSF, а затем обрабатывали различными концентрациями WPCD (0,01, 0,02, 0,05, 0,1 и 0,2 мг / мл) в течение 12 часов в трех повторностях. ЛПС (100 нг / мл) использовали в качестве положительного контроля. После промывания BM-DC в PBS и использования Fc Block (BD Biosciences, CA) для предотвращения неспецифического связывания антител клетки окрашивали в PBS с использованием соответствующих FITC-, PE- или APC-конъюгированных CD40, CD11c, CD86, CD80 и антитела MHC-II (BD) в течение 20 мин при 37 ° C.Окрашенные клетки выявляли с помощью FACs Calibur (BD). Анализ данных проводился с помощью программного обеспечения FlowJo (Tree Star).

В эксперименте по созреванию DC in vitro супернатанты клеточных культур также собирали для анализа IL-12 и TNF-α с использованием наборов для анализа цитокинов (Boster, Wuhan, China) в соответствии с инструкциями производителя. Поглощение при 450 нм измеряли с помощью планшет-ридера для ELISA (Bio-Rad, США). Количества цитокинов в образцах рассчитывали с помощью стандартных кривых рекомбинантных цитокинов согласно линейному методу регрессии.

Чтобы проверить их аллогенную стимулирующую активность, был проведен эксперимент смешанной реакции лимфоцитов (MLR) в соответствии с предыдущим методом [26] с помощью анализа MTT (Sigma, St Louis, MO). Вкратце, BM-DC мышей C57BL / 6, использованные в качестве клеток-стимуляторов, выделяли на 7 день в среде RPMI-1640 плюс GM-CSF и обрабатывали различными концентрациями WPCD в течение 12 часов при 37 ° C. Клетки промывали и ресуспендировали в среде RPMI-1640 перед посевом в 24-луночный планшет. Суспензии одиночных пленоцитов в качестве отвечающих клеток выделяли от мышей BALB / c.BM-DC смешивали со спленоцитами в соотношении 1: 5 и 1:10. Клетки культивировали при 37 ° C в атмосфере 5% CO ₂ в течение трех дней в трех повторностях. Обработку LPS использовали в качестве положительного контроля. Затем в культуры добавляли 20 мкл МТТ для последнего 4-часового культивирования. Для анализа пролиферации Т-клеток измеряли оптическую плотность при длине волны измерения (490 нм) и эталонной длине волны (650 нм). Все образцы были измерены на фоне контроля.

Лечение ингибитором TLR4

in vitro

BM-DC предварительно обрабатывали 5 мкМ TAK-242 (ингибитор TLR4, Medchemexpress Inc.USA) в течение 1 часа, а затем совместно культивировали с различными концентрациями WPCD (100 и 200 мкг / мл) в течение 12 часов в присутствии или в отсутствие Golgi Stop в трех повторностях. В положительном контроле добавляли ЛПС. Клетки и супернатанты были обнаружены с помощью FAC для анализа поверхностных маркеров CD86 и CD40 и с помощью ELISA для анализа цитокинов TNF-a и IL-12 соответственно.

Протокол иммунизации

Тест на острую токсичность.

В этом исследовании в испытании на острую пероральную токсичность использовали 40 здоровых взрослых мышей ICR.Перед введением дозы мышей ICR не кормили (пища, но не вода в течение ночи). WPCD вводили перорально соответственно в дозах 0, 50, 500 или 5000 мг / кг веса тела каждому животному в течение 7 дней. Мыши, обработанные физиологическим раствором и обработанные квасцами, были включены в контрольную группу. За животными наблюдали ежедневно в течение 14 дней подряд. За мышами индивидуально наблюдали для регистрации смертности и клинических признаков. Кроме того, на протяжении всего эксперимента измеряли вес тела и потребление пищи и воды.На 14 день рассчитывали индекс селезенки или тимуса как: (масса селезенки или тимуса / масса тела) × 10.

Обнаружение иммуномодулирующей активности WPCD

in vivo .

Чтобы выяснить, обладает ли WPCD иммуномодулирующей активностью, в качестве модельного антигена использовали овальбумин (OVA) (Sigma), и самки мышей ICR были случайным образом разделены на 7 групп (группа отрицательного контроля (0,9% NaCl и WPCD 400 мкг) и положительная контроль (квасцы 200 мкг с OVA)). Мышам дважды вводили подкожно только 10 мкг OVA или WPCD с OVA в соответствии с дозой 20, 100 или 400 мкг с интервалом в 2 недели.Образцы крови и селезенки были получены после повторной вакцинации для определения титров IgG, подклассов IgG, пролиферации и цитокинов спленоцитов, поверхностных маркеров DC и частоты Treg.

Обнаружение OVA-специфических антител

OVA-специфических IgG титров и подклассов исследовали с помощью ELISA в соответствии с предыдущим методом [27]. Планшеты для ELISA (Nunc, Thermo Fisher Scientific) покрывали в течение ночи и затем блокировали. Образцы сыворотки были серийно разведены для анализа титра IgG или обнаружения IgG ₁ и IgG _2a (Southern Biotech, Inc.). Затем планшеты инкубировали с PBST, содержащим конъюгированные с HRP антимышиные IgG, IgG ₁ и IgG _2a в течение 1 часа при 37 ° C. Колориметрическую реакцию проводили с тетраметилбензидином (TMB), а затем измеряли оптическую плотность при 450 нм / 655 нм и выражали в единицах оптической плотности (OD).

Обнаружение пролиферации спленоцитов и цитокинов

Пролиферацию спленоцитов определяли с помощью МТТ-анализа. На 21 день после первой вакцинации получали суспензию единичных спленоцитов.Клетки культивировали в среде RPMI-1640 в 96-луночных планшетах в соответствии с концентрацией 1 × 10 ⁶ клеток / лунку в трех повторностях. Культуры стимулировали OVA (конечная концентрация 10 мкг / мл), ConA (конечная концентрация 5 мкг / мл) (Sigma, St Louis, MO) и LPS (конечная концентрация 100 нг / мл) в течение 48 ч при 37 ° C. . Клетки культивировали в течение 48 часов, в каждую лунку добавляли 20 мкл (5 мг / мл) МТТ (Sigma, St Louis, MO) и инкубировали еще 4 часа. После добавления 50 мкл ДМСО в каждую лунку для остановки развития окраски (Sigma) планшеты считывали при 570 нм с помощью устройства для считывания микротитровальных планшетов (Bio-Rad, Калифорния, США).Пролиферацию спленоцитов выражали как индекс стимуляции (SI), который представлял собой отношение OD _{570 нм} стимулированной лунки к нестимулированной лунке.

Выходы IL-4 и IFN-γ в Т-клетках измеряли путем окрашивания внутриклеточных цитокинов в соответствии с опубликованным протоколом с небольшими модификациями [27, 28]. Суспензию единичных спленоцитов готовили на 21 день после первой вакцинации. После лизиса эритроцитов спленоциты (2 × 10 ⁶ клеток / мл) инкубировали с OVA (10 мкг / мл) для 4-часовой стимуляции и добавляли стоп Гольджи (BD) на 12 часов инкубации, PMA как положительный контроль.Клетки собирали, промывали PBS, окрашивали CD4-FITC / CD8-FITC, фиксировали и повышали проницаемость с помощью набора Cytofix / Cytoperm (BD) в соответствии с инструкциями производителя. Окрашивание внутриклеточных цитокинов проводили соответствующей концентрацией антител к IL-4-PE или IFN-γ-APC при 4 ° C в течение 20 мин. Окрашенные клетки выявляли с помощью FAC. Анализ данных проводился в FlowJo.

Оценка созревания ДК и Treg-клеток в селезенке

Для анализа созревания ДК из спленоцитов мышей окрашивание клеточной поверхности проводили с помощью антител к CD11c-PE, CD40-FITC и CD80-APC.На 3 день после первой вакцинации получали суспензию единичных спленоцитов (1 × 10 ⁶ клеток / мл), и клетки подвергали двойному окрашиванию. Интенсивность флуоресценции измерялась FACs Calibur, а измеренные данные анализировались FlowJo.

Чтобы выяснить, может ли WPCD подавлять частоту CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Treg-клеток. Суспензию единичных спленоцитов готовили на 7 день после второй вакцинации. Спленоцит (2 × 10 ⁶ клеток / мл) подвергали окрашиванию клеточной поверхности антителом CD4-APC с последующим окрашиванием ядерных цитокинов соответствующими антителами CD25-FITC и Foxp3-PE с помощью набора для окрашивания регуляторных Т-клеток мыши. (eBiosciences) в соответствии с инструкциями производителя.Частоту CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Treg-клеток тестировали на FAC. Анализ данных проводился в FlowJo.

Статистический анализ

Тесты однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) (тест множественного сравнения Тьюки) проводили для анализа различий между несколькими экспериментальными группами. Все значения выражены как среднее ± стандартное отклонение. P <0,05 считается статистически значимым. Статистический анализ проводился с использованием Prism 5.0 программное обеспечение.

Результаты

WPCD способствует созреванию и функционированию BM-DC

in vitro

Адаптивный иммунитет определяется активацией ДК, включая типы костимулирующих молекул и цитокинов [29, 30]. Первоначально мы исследовали, может ли WPCD способствовать экспрессии костимулирующих молекул. В соответствии с различными дозами WPCD вводили BM-DC из C57BL / 6. Уровни экспрессии CD11c, CD86, CD80, CD40 и MHC-II в клетках были проанализированы (рис. 1).Клетки, обработанные SSC и FSC, показали, что обработка разными дозами WPCD не изменяла морфологию BM-DC (данные не показаны). Уровни экспрессии CD86, CD80 и CD40 были значительно повышены дозозависимым образом по сравнению с необработанной группой и достигли плато при дозе 20 мкг / мл WPCD, но разница не была значительной по сравнению с LPS. группа (рис. 1A – 1C). Уровень экспрессии MHC-II был значительно увеличен до максимального значения при дозе 50 мкг / мл (рис. 1D).Результаты анализа маркеров клеточной поверхности показали, что ДК, обработанные LPS или WPCD, показали значительно повышенные уровни экспрессии CD86, CD80, CD40 и MHC-II и стимулировали фенотипическое созревание.

Рис. 1. Влияние WPCD на фенотипическое созревание ДК in vitro .

BM-DC мышей C57BL / 6 обрабатывали различными концентрациями WPCD в течение 12 часов. ЛПС использовали в качестве положительного контроля. Затем были проанализированы уровни экспрессии CD11c, CD40, CD80, CD86 и MHC-II в клетках.Фенотипическое созревание BM-DC индуцировали PBS, LPS и WPCD. Показаны средние значения интенсивности флуоресценции (MFI) CD40 (A) , CD80 (B) , CD86 (C) и MHC-II (D) . Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение (n = 3) из 3 независимых экспериментов. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 по сравнению с группой нелеченных DC.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.01.g001

Некоторые адъюванты могут увеличивать костимуляторные молекулы на ДК или напрямую индуцировать секрецию цитокинов.IL-12 и TNF-α являются основными цитокинами для активации иммунного ответа Th2. Мы проанализировали выход цитокинов в BM – DC после обработки WPCD. После обработки BM-DC различным содержанием WPCD в течение 12 часов супернатант собирали для определения содержания IL-12 и TNF-α с помощью набора для ELISA. WPCD может дозозависимо увеличивать продукцию IL-12 (фиг. 2A) и TNF-α (фиг. 2B). Результаты показали, что WPCD может вызывать функциональное созревание DC.

Рис. 2. Влияние WPCD на продукцию цитокинов и функциональную активацию DC in vitro .

После обработки ДК различными концентрациями WPCD в течение 12 часов супернатант собирали и с помощью ELISA детектировали продукцию IL-12 и TNF-α. Показаны концентрации IL-12 (A) и TNF-α (B) . Аллогенную пролиферацию Т-клеток DC, обработанных WPCD, анализировали с помощью MLR. Аллогенные Т-клетки совместно культивировали в течение 3 дней в указанном соотношении с DC, которые культивировались в течение 12 часов в трех повторностях (C и D) . МТТ добавляли в культуры для последней 4-часовой обработки, а затем определяли пролиферацию Т-клеток с помощью ридера ELISA.Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение (n = 3) из 3 независимых экспериментов. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 по сравнению с группой необработанных DC.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.01.g002

При иммунном ответе необходимо функционально активировать DC. Затем полностью зрелые ДК индуцировали более высокий уровень пролиферации аллогенных Т-клеток. Таким образом, функциональная реакция DC на WPCD была исследована MLR.Аллостимулирующая способность ДК, индуцированных WPCD, как и LPS, резко увеличивалась в зависимости от дозы при указанном соотношении (рис. 2C и 2D). Результаты показали, что WPCD улучшил презентацию антигена и оптимизировал Т-клеточный ответ с помощью MLR in vitro .

WPCD способствует созреванию DC через путь TLR4

Из приведенных выше результатов можно сделать вывод, что BM-DCs, активированные с помощью WPCD, показали сходные экспрессии поверхностных молекул DC с LPS (лигандом TLR4).Таким образом, мы предположили, что BM-DCs активируются с помощью WPCD через путь TLR4. После предварительной обработки BM-DC TAK-242 (ингибитор TLR4) и совместного культивирования с WPCD и LPS в течение 12 часов экспрессия CD40, CD86, TNF-a или IL-12 определялась с помощью FAC или ELISA. Как показано на фиг. 3A и 3B, обработка TAK-242 привела к значительному подавлению экспрессии CD40 и CD86, индуцированной LPS или WPCD, а продукция цитокинов IL-12 или TNF-a также значительно снизилась (фиг. 3C и 3D). Результаты показали, что WPCD может активировать созревание DC через путь TLR4.

Рис. 3. Влияние WPCD на функцию BM-DC через TLR4-опосредованный путь.

После предварительной обработки 5 мкМ TAK-242 в течение 1 часа BM-DC обрабатывали 100 нг / мл LPS или 100 и 200 мкг / мл WPCD в течение 12 часов в присутствии или в отсутствие Golgi Stop. Затем экспрессию CD40, CD86, TNF-a и IL-12 определяли с помощью FAC или ELISA. Показаны значения MFI для CD40 (A) и CD86 (B) , выходы TNF-a (C) и IL-12 (D) . Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение (n = 3) из 3 независимых экспериментов.* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 по сравнению с группой нелеченных DC.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.01.g003

WPCD повышает гуморальный и клеточный иммунитет

С целью сравнения мы оценили влияние WPCD на возникновение гуморального иммунного ответа у мышей, иммунизированных OVA. Перед вакцинацией и на 14, 21, 35 и 49 дни после первой вакцинации собирали кровь для определения титра IgG и сыворотки подклассов IgG с помощью ELISA.Ответ антител IgG на OVA увеличивался с увеличением дозы введения WPCD (100 и 400 мкг) дозозависимым образом (рис. 4). Оптимальная концентрация WPCD составляла 100 мкг / мл и увеличивала ответы IgG в два раза по сравнению с одним только OVA на 21, 35 и 49 дни (рис. 4A). Значительное увеличение уровней OVA-специфических антител IgG ₁ и IgG _2a при введении WPCD менее 20 и 100 мкг было получено по сравнению с группой OVA в сыворотке на 35 день (рис. 4B).Между тем, Alum стимулировал только уровни экспрессии OVA-специфических антител IgG и IgG ₁ у иммунизированных мышей. Сам по себе WPCD не запускал OVA-специфические антитела. Приведенные выше результаты, очевидно, указывают на то, что WPCD генерирует более высокие титры антител и более сбалансированные ответы Th2 / Th3, чем квасцы.

Рис. 4. Влияние WPCD на OVA-специфические IgG и подклассы IgG.

Влияние WPCD на OVA-специфические IgG, IgG ₁ и антитела IgG _2a в сыворотке оценивали с помощью ELISA.Титр IgG на 14, 21, 35 и 49 дни после первой вакцинации (A) , уровни антител IgG ₁ и IgG _2a на 35 день после первой вакцинации (B). Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение (n = 5) из 3 независимых экспериментов. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 по сравнению с группой OVA; ^## P <0,01, ^### P <0,001 по сравнению с группой OVA / Alum.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.01.g004

Пролиферация спленоцитов — еще один индикатор клеточного иммунитета. ConA стимулирует Т-клетки, а ЛПС стимулирует пролиферацию В-клеток. На 21 день после первой вакцинации была получена суспензия отдельных спленоцитов и соответственно стимулирована OVA (10 мкг / мл), OVA ^323-339 (10 мкг / мл) пептидом, ConA (5 мкг / мл) и LPS (5 мкг / мл). мкг / мл) в течение 48 ч. Затем измеряли пролиферацию Т-клеток методом МТТ.WPCD может значительно стимулировать OVA-антиген, Con A-митоген и LPS-митоген-стимулированную пролиферацию спленоцитов у мышей, иммунизированных OVA и WPCD (рис. 5), а оптимальная концентрация WPCD составляла 100 мкг / мл. Эти данные показали, что WPCD в качестве адъюванта вакцины у мышей, иммунизированных OVA, может более эффективно индуцировать активацию Т-клеток и В-клеток, чем квасцы.

Рис. 5. Влияние WPCD на пролиферацию спленоцитов.

Отдельные спленоциты выделяли от мышей, иммунизированных на 21 день после первой вакцинации, и определяли пролиферацию спленоцитов с помощью анализа МТТ и выражали как SI.OVA-антиген стимулировал пролиферацию спленоцитов (A) . OVA ^323-339 -антиген стимулировал пролиферацию спленоцитов (B). ConA-митоген стимулировал пролиферацию спленоцитов (C) . LPS-митоген пролиферация спленоцитов (D) . Данные выражены как среднее ± стандартное отклонение (n = 5) из 3 независимых экспериментов. * P <0,05, ** P <0,01 по сравнению с группой OVA; ^# P <0,05, ^## P <0.01 по сравнению с группой OVA / Alum.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.01.g005

Все протестированные адъюванты WCPD, приготовленные с вакцинами OVA, генерировали одинаково сильный гуморальный и клеточный иммунитет (рис. 4 и 5). На основе этих данных, чтобы дополнительно оценить влияние WPCD на OVA-специфический ответ Т-хелперных (Th) клеток, мы дополнительно проанализировали экспрессию цитокинов в Т-клетках CD8 ⁺ и CD4 ⁺ с помощью проточной цитометрии (рис. 6). На 21 день после первой вакцинации один спленоцит мышей выделяли и затем совместно культивировали с OVA (10 мкг / мл).Выход IL-4 в CD4 ⁺ Т-клетках в группе, которой вводили 100 мкг OVA / WPCD, был значительно выше, чем в группе OVA / Alum и группе OVA, и аналогичен таковому в PMA (фиг. 6A). Более того, выход IFN-γ в Т-клетках CD8 ⁺ и CD4 ⁺ также был значительно увеличен у мышей, которым вводили OVA / WPCD (20, 100 и 400 мкг) (рис. 6B и 6C). По сравнению с адъювантом квасцов WPCD продемонстрировал лучшую способность индуцировать секрецию IL-4 и IFN-γ Т-клетками.

Рис 6.Влияние WPCD на продукцию IL-4 и IFN-γ спленоцитами.

На 21 день после первой вакцинации одиночный спленоцит был изолирован от иммунизированных мышей и совместно культивирован с OVA (10 мкг / мл) в течение 12 часов. Продукция IFN-γ и IL-4 определялась FCA _S. Продукция IL-4 в CD4 ⁺ T-клетках (A) , продукция IFN-γ в CD8 ⁺ T-клетках (B) и продукция INF-γ в CD8 ⁺ T-клетках (C) . Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение (n = 5) из 3 независимых экспериментов.* P <0,05, ** P <0,01 по сравнению с группой OVA; #P <0,05, ## P <0,01 по сравнению с группой OVA / Alum.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.01.g006

WPCD стимулирует созревание DC и снижает частоту Treg

in vivo ДК

признаны наиболее мощными АРС, участвующими в инициации первичных иммунных ответов. Таким образом, на 3-й день после первой вакцинации мы также исследовали влияние WPCD на CD40 и CD80 на DC в селезенке у мышей (рис. 7A и 7B).Мыши в группе 100 мкг OVA / WPCD продуцировали значительно более высокие уровни CD40 и CD80 на DC, чем в группе OVA / Alum. Эти данные показали, что WPCD может активировать DC и вызывать созревание DC у мышей.

Рис. 7. Влияние WPCD на созревание DC и частоту Treg.

На 3 или 21 день после первой вакцинации клетки были отделены от селезенки каждой группы мышей, и уровни экспрессии CD11C ⁺ CD40 ⁺ и CD11C ⁺ CD80 ⁺ на DC, а также Частота CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ была измерена с помощью FCA _S.Экспрессия CD11C ⁺ CD40 ⁺ (A) и CD11C ⁺ CD80 ⁺ (B) на ДК в селезенке на 3-й день после первой вакцинации. Частота CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Treg в общем количестве CD4 ⁺ Т-клеток в селезенке на 7 день после второй вакцинации (C) . Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение (n = 5) из 3 независимых экспериментов. * P <0,05 по сравнению с группой OVA.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.01.g007

Treg-клетки могут уравновешивать толерантность и иммунные ответы. Для дальнейшего изучения того, как WPCD модулирует иммунный ответ, Treg-клетки в селезенке мышей окрашивали с помощью набора для окрашивания регуляторных Т-клеток мыши. На 21 день после первой вакцинации наблюдалась пониженная частота CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Treg-клеток в общем количестве CD4 ⁺ Т-клеток (фиг. 7C). По сравнению с группами OVA и OVA / Alum, группа WPCD показала значительно сниженную частоту Treg.

Оценка безопасности WPCD на мышах

Чтобы оценить острую пероральную токсичность, мы провели тест на острую токсичность. Мыши, которым перорально вводили 5000 мг / кг массы тела, не проявляли аномального поведения или побочных эффектов, и в тесте оценки токсичности не было обнаружено смертности. Не было зарегистрировано значительных различий в приросте массы тела, индексе тимуса и индексе селезенки среди разных групп мышей, которым вводили разные дозы WPCD, и не было значимой разницы (таблица 1).Через 14 дней смертности не наблюдалось. Следовательно, значение WPCD для LD ₅₀ было более 5000 мг на кг массы тела.

Чтобы проверить, оказывает ли WPCD отрицательное влияние на рост мышей до и после подкожной вакцинации, для каждой мыши соответственно определяли массу тела (таблица 2). При последующем наблюдении за мышами побочных эффектов или аномального поведения не наблюдалось. Кроме того, масса тела мышей, которым вводили WPCD, и мышей, которым вводили физиологический раствор или OVA / Alum, не показала значительной разницы.Эти результаты наблюдения показали, что введение WPCD было безопасным.

Обсуждение

Адъюванты — ключевые компоненты вакцин [31]. Благодаря достижениям в области геномики и протеомики выявляется все больше и больше рекомбинантов и синтетических молекул вакцин. Следовательно, требуется больше адъювантов и составов. Некоторые сильнодействующие адъюванты обычно связаны с повышенной токсичностью, например FCA. Следовательно, необходимо найти безопасный состав, содержащий различные синергические компоненты, в конечном итоге вызывающие желаемый иммунный ответ.Полисахариды китайских трав нетоксичны и не проявляют значительных побочных эффектов [32,28]. Для определенной вакцины требуется безопасный адъювант.

Cistanche deserticola — важное тонизирующее растение, широко распространенное в засушливых и теплых пустынях на северо-западе Китая. Cistanche deserticola широко вызывает опасения из-за его биоактивности, включая иммуномодулирующее, антиоксидантное, антибактериальное и противоопухолевое действие [20,21]. Был достигнут некоторый прогресс в структурной характеристике и иммунологической активности Cistanche deserticola , который является хорошим кандидатом для разработки адъювантов.Мы экспериментально оценили адъювантные эффекты и механизм WPCD in vitro и in vivo . Подкожное введение WPCD значительно способствовало гуморальным и клеточным иммунным ответам за счет увеличения сывороточных антител и пролиферации лимфоцитов, усиления экспрессии цитокинов, повышения регуляции созревания ДК и подавления частоты CD4 ⁺ CD25 ⁺ Foxp3 ⁺ Treg-клеток.

DC являются ключевыми APC для прайминга наивных Т-клеток.Активация DC важна для адъювантов. ДК, особенно ДК, полученные из костного мозга мыши, часто используются для оценки адъювантов и вакцин. Проточная цитометрия может отличить клетки, которые были активированы после захвата антигена, от окружающих клеток. В анализе FCM степень агрегации стимулированных клеток является косвенным показателем оценки безопасности иммуномодуляторов [3]. Таким образом, данные об адъювантной активности WPCD в DC in vitro могут предоставить ценную информацию для моделей на животных.На основе модели BM-DC уровни экспрессии MHC-II, CD86, CD80 и CD40, продукция цитокинов и пролиферация аллогенных Т-клеток были обнаружены в оптимальном диапазоне концентраций WPCD. Уровни экспрессии MHC-II, CD86, CD80 и CD40 повышались в BM-DC, а выходы TNF-a и IL-12 увеличивались в зависимости от дозы. Наблюдалась пролиферация аллогенных Т-клеток. Морфология BM-DC не изменилась. Индуцируя активацию BM-DC и секрецию воспалительных цитокинов in vitro , адъювант WPCD может значительно увеличить количество антигена и количество APC и стимулировать Т-клетки секретировать IFN-γ, что способствует усилению иммуномодулирующей активности.

Различные полисахариды китайских трав способны активировать иммунную систему и обладают превосходными адъювантными способностями за счет стимуляции созревания ДК по пути TLR4 [33,28]. Таким образом, мы предполагаем, что TLR4 участвует в сигнальном пути созревания DCs, индуцированного WPCD. Как и ожидалось, лечение ингибитором TLR4 приводило к значительному снижению TNF-a и IL-12. Кроме того, ингибирование пути TLR4 также препятствует экспрессии CD 40 и CD80 на DC, указывая на то, что созревание DC зависит от TLR4.Следовательно, очевидно, что TLR4 участвует в созревании DCs, индуцированном WPCD.

Оптимальная доза адъювантов и вакцинная композиция определяется эмпирически во многих экспериментах. Чтобы изучить взаимосвязь доза-ответ адъюванта WPCD и антигенов OVA у мышей, мы выбрали различные дозы WPCD на основе ранее опубликованных данных для BM-DC in vitro для подкожного введения мышам ICR дважды. Мы обнаружили, что WPCD значительно увеличивает выход OVA-специфических антител и индуцирует сбалансированный иммунный ответ Th2 / Th3 с повышением уровней IgG ₁ и IgG _2a.В частности, уровень IgG _2a был выше, чем уровень, обработанный квасцами в оптимальной дозе. Следовательно, WPCD приводил к более высоким уровням специфических антител и более высокой эффективности при более низких инъекциях.

Новые вакцины требуют индукции сильных клеточных ответов, которые включают антитела, Т-хелперные (Th) клетки и цитотоксические Т-лимфоциты (CTL). Терапевтическая вакцина направлена на усиление Т-клеточного ответа. Идеальный адъювант повышает эффективность вакцины и способствует клеточному иммунитету, не вызывая токсических эффектов [34].Среди наблюдений на иммунизированных моделях мышей WPCD приводил к увеличению OVA-специфической и неспецифической пролиферации спленоцитов по сравнению с Alum. Некоторые адъюванты активируют цитокины и иммунную систему. Например, сапонины могут стимулировать клеточно-опосредованные иммунные ответы на антиген, который обычно индуцирует только антитела. Мы выбрали IL-4 и IFN-γ в качестве индикаторов для косвенной оценки уровней иммунитета у мышей. WPCD может индуцировать больше секреции IL-4 и IFN-γ, чем Alum. Таким образом, сильные ответы Т-хелперов и секреция цитокинов наблюдались в результате вакцинации WPCD, предполагая, что WPCD может более эффективно стимулировать лимфоциты секретировать цитокин Th2-типа и цитокин Th3-типа, чем квасцы.

Адъюванты, влияющие на презентацию антигена, могут влиять на сложные иммунные процессы. Treg-клетки могут модулировать ответы Th2 и Th3 [35]. Соответствующая доза WPCD может способствовать созреванию DC у мышей за счет увеличения уровней экспрессии CD80 и CD40 и усиления способности презентации антигена OVA в раннем иммунном ответе. Экспериментальные результаты активации DC и частоты Treg продемонстрировали, что WPCD индуцирует созревание DC и снижает частоту Treg в селезенке у мышей.Эти результаты доказали, что WPCD повышает эффективность вакцин OVA за счет увеличения нацеливания на антигенпрезентирующие клетки и стимулирования специфической активации Т-клеток.

При разработке адъювантов сложно избирательно индуцировать соответствующий иммунный ответ против соответствующей инфекции. Подходящий адъювант должен иметь низкие побочные эффекты и токсичность для людей или животных. Таким образом, следует учитывать безопасность WPCD, включая немедленные и долгосрочные побочные эффекты. В этом исследовании мы изучили острую токсичность WPCD и отрицательное влияние WPCD на показатели роста мышей в течение 110 дней.Результаты острой токсичности WPCD показали, что масса тела, индекс тимуса или индекс селезенки не имели существенных различий. Значение LD50 WPCD составляло более 5000 мг на кг массы тела. В ходе последующего экспериментального наблюдения за мышами не было обнаружено никаких побочных эффектов или аномального поведения у мышей. Эти результаты показали, что WPCD безопасен.

В заключение, в этом исследовании WPCD, неочищенный полисахарид, извлеченный из C . deserticola из Синьцзяна проявляет некоторые свойства адъювантов.Например, WPCD усиливал ответы Th2 и Th3 за счет активации DC, усиления ответов антител, улучшения продукции цитокинов. Более того, мы исследовали механизм эффективности WPCD путем анализа созревания и функции DCs посредством пути TLR4 in vitro . У мышей, получавших только WPCD, явных побочных эффектов не наблюдалось. Следовательно, WPCD обладает более высокой иммуностимулирующей активностью в отношении клеточного и гуморального иммунного ответа. Адъюванты представляют собой смесь нескольких соединений. Смесь нескольких неочищенных экстрактов может иметь больший положительный эффект, чем один растительный экстракт.Необходимо систематически изучать экстракты WPCD, проверять их эффективность и безопасность, а также выяснять механизмы их воздействия.

Благодарности

Особая благодарность Бин Вангу и Даочэн Ву за предоставление хороших идей в ходе экспериментов.

Список литературы

1. Хантер Р.Л. Обзор адъювантов вакцины: настоящее и будущее. Вакцина. 2002; 20: S7 – S12. pmid: 12184369
2. Плоткин С. История вакцинации.Proc Natl Acad Sci USA. 2014; 111: 12283–12287. pmid: 25136134
3. Гай Б. Идеальное сочетание: недавний прогресс в исследованиях адъювантов. Nat Rev Microbiol. 2007; 5: 505–517. pmid: 17558426
4. Рид С.Г., Бертолет С., Колер Р.Н., Фриде М. Новые горизонты адъювантов для разработки вакцин. Trends Immunol. 2009; 30: 23–32. pmid: 104
5. Рид С.Г., Орр М.Т., Фокс СВ. Ключевые роли адъювантов в современных вакцинах. Nat Med. 2013; 19: 1597–1608. pmid: 24309663
6.Де Грегорио Э., Тритто Э., Раппуоли Р. Адъювантность квасцов: разгадывать вековую тайну. Eur J Immunol. 2008; 38: 2068–2071. pmid: 18651701
7. Borchers AT, Hackman RM, Keen CL, Stern JS, Gershwin ME. Дополнительная медицина: обзор иммуномодулирующих эффектов китайских лекарственных трав. Am J Clin Nutr. 1997; 66: 1303–1312. pmid: 9394679
8. Zhang Q, Yu J, Zhang L, Hu M, Xu Y, Su W. Экстракция, характеристика и биологическая активность полисахаридов из софоры flavescens, ait.Int J Biol Macromol. 2016; 93: 459–467. pmid: 27554935
9. Lin CC, Pan IH, Li YR, Pan YG, Lin MK, Lu YH и др. Адъювантные эффекты высокомолекулярных полисахаридов, очищенных из antrodia cinnamomea, на функцию дендритных клеток и ДНК-вакцины. Plos One. 2015; 10: e0116191. eCollection 2015 pmid: 25723174
10. Saade F, Honda-Okubo Y, Trec S, Petrovsky N. Новая вакцина против гепатита B, содержащая Advax ™, полисахаридный адъювант, полученный из дельта-инулина, индуцирует устойчивый гуморальный и клеточный иммунитет с минимальной реактогенностью в доклинических испытаниях.Вакцина. 2013; 31: 1999–2007. pmid: 23306367
11. Honda-Okubo Y, Barnard D, Ong CH, Peng BH, Tseng CTK, Petrovsky N. Вакцины против коронавируса, связанные с тяжелым острым респираторным синдромом, в состав которых входят адъюванты дельта-инулина, обеспечивают повышенную защиту и улучшают эозинофильную иммунопатологию легких. J Virol. 2015; 89: 2995–3007. pmid: 25520500
12. Вэй В., Сяо Х.Т., Бао В.Р., Ма Д.Л., Люн Ч.Х., Хан Х.К. и др. TLR-4 может опосредовать сигнальные пути полисахарида астрагала, индуцированного RAP, цитокиновой экспрессии RAW264.7 сот. J Ethnopharmacol. 2016; 179: 243–252. pmid: 26743224
13. Цзинь М., Чжао К., Хуанг К. Шан П. Структурные особенности и биологическая активность полисахаридов из астрагала перепончатого. Int J Biol Macromol. 2014; 64: 257–266. pmid: 24325861
14. Су CX, Дуан XG, Liang LJ, Zheng J, Fu XY, Yan YM и др. Полисахариды Lycium barbarum в качестве адъюванта для рекомбинантной вакцины за счет повышения гуморального иммунитета путем активации клеток Tfh.Вет Иммунол Иммуноп. 2014; 158: 98–104. pmid: 23759470
15. Бо Р, Чжэн С., Син Дж., Ло Л, Ню Й, Хуанг И и др. Иммунологическая активность липосом полисахаридов Lycium barbarum in vitro и адъювантность против pcv2 in vivo. Int J Biol Macromol. 2016; 85: 294–301. pmid: 26763175
16. Ван Т., Чжан X, Се В. Cistanche deserticola Y. C. Ma, «пустынный женьшень»: обзор. Am J Chin Med. 2012; 40: 1123–1141. pmid: 23227786
17. Бугандура А., Д’Аброска Б., Амедда С., Скогнамиглио М., Меккиу Р., Фиорентино А. и др.Химические составляющие и противовоспалительная активность in vitro cistanche violacea, desf. (orobanchaceae) экстракт. Фитотерапия. 2016; 109: 248–253. pmid: 26784519
18. Линь Л.В., Се М.Т., Цай Ф.Х., Ван В.Х., Ву ЧР. Антиноцицептивное и противовоспалительное действие, вызываемое Cistanche deserticola у грызунов. J Ethnopharmacol. 2002; 83: 177–182. pmid: 12426084
19. Цзян И, Ту ПФ. Анализ химических составляющих у видов цистанхе. J Chromatogr A. 2009; 16: 1970–1979.PMID: 18691718
20. Инан З.Д., Цзэн К.В., Ши С.П., Чжао МБ, Цзян Й., Ту ПФ. Фенилэтаноидные гликозиды с противовоспалительным действием из стеблей Cistanche deserticola, выращиваемых в пустыне Тарим. Фитотерапия. 2013; 89: 167–174. pmid: 23685247
21. Чжан В., Хуанг Дж., Ван В., Ли К., Чен Ю., Фэн В. и др. Экстракция, очистка, характеристика и антиоксидантная активность полисахаридов из Cistanche tubulosa. Int J Biol Macromol. 2016; 93: 448–458.pmid: 27593241
22. Харт DN. Дендритные клетки: уникальные популяции лейкоцитов, которые контролируют первичный иммунный ответ. Кровь. 1997; 90: 3245–3287. pmid: 9345009
23. Ван З, Мэн Дж, Ся Й, Мэн Ю, Ду Л, Чжан Зи и др. Созревание дендритных клеток костного мозга мышей, индуцированное кислыми полисахаридами женьшеня. Int J Biol Macromol. 2013; 53: 93–100. pmid: 23164755
24. Дюбуа М., Жиль К., Гамильтон Дж. К., Реберс П.А., Смит Ф.А. Колориметрический метод определения сахаров.Природа. 1951; 168: 167. pmid: 14875032
25. Инаба К., Инаба М., Романи Н., Ая Х, Дегучи М., Икехара С. и др. Генерация большого количества дендритных клеток из культур костного мозга мышей с добавлением колониестимулирующего фактора гранулоцитов / макрофагов. J Exp Med. 1992; 176: 1693–1702. pmid: 1460426
26. Ван Х, Донг А, Сяо Дж, Чжоу Х, Ми Х, Сю Х и др. Преодоление иммунной толерантности к HBV с целью устранения HBsAg-положительных гепатоцитов путем предварительного введения GM-CSF в качестве нового адъюванта для вакцины против гепатита B трансгенным мышам HBV.Cell Mol Immunol. 2016; 13: 850–861. pmid: 26166767
27. Чжан А., Ли Дж., Чжао Дж., Гэн С., Чжуан С., Ван Б. и др. Совместное интраназальное введение с конструкцией, экспрессирующей zona pellucida 3 мыши, и ее кодирующим белком индуцирует контрацепцию у мышей. Вакцина. 2011; 29: 6785–6792. pmid: 21262188
28. Steinman RM. Дендритные клетки in vivo: ключевая цель новой науки о вакцинах. Иммунитет. 2008; 29: 319–324. pmid: 18799140
29. Лим Т.С., На К., Чой Э.М., Чунг Дж.Й., Хван Дж.Иммуномодулирующая активность полисахаридов, выделенных из женьшеня Panax. J. Med. Еда. 2004; 7: 1–6. pmid: 15117545
30. Вакцины Р. Раппуоли: наука, здоровье, долголетие и богатство. Proc Natl Acad Sci USA. 2014; 111: 12282. pmid: 25299004
31. Чанг В.Т., Лай Т.Х., Чиан Ю.Дж., Инь С.Ю., Чен Ю.Х., Вэй В.С. и др. Специфические полисахариды лекарственных растений эффективно повышают эффективность вакцины на основе DC против метастазов опухоли молочной железы мышей. ПлоС один.2015; 10: e0122374. pmid: 25825910
32. Чжан А., Ян И, Ван И, Чжао Г, Ян Х, Ван Д. и др. Адъювантно-активные водные экстракты из Artemisia rupestris L. улучшают иммунные ответы через сигнальный путь TLR4. Вакцина. 2017; 35: 1037–1045. pmid: 28111143
33. Kim JY, Kim YJ, Kim JS, Ryu HS, Lee HK, Kang JS и др. Адъювантный эффект природного лиганда TLR4 на иммунотерапию рака на основе дендритных клеток. Рак пусть. 2011; 313: 226–234. pmid: 21974804
34.Алвинг ЧР, Пичман К.К., Рао М., Рид С.Г. Адъюванты для человеческих вакцин. Curr Opin Immunol. 2012; 24: 310–315.

Статьи об иммунитете, как поддерживать крепкий иммунитет на протяжении всех сезонов года

Статьи об иммунитете, как поддерживать крепкий иммунитет на протяжении всех сезонов года

Статьи об иммунитете, как поддерживать крепкий иммунитет на протяжении всех сезонов года

Травы-иммуномодуляторы : Включи настроение

Растения-иммуностимуляторы помогут избежать гриппа / Полтавщина

Как укрепить иммунитет

Иммунолог — о борьбе иммунитета против коронавируса – Газета.uz

— COVID-19 — совершенно новый вид инфекции, и поэтому у нас нет к ней иммунитета?

— Как формируется иммунитет к COVID-19?

— Можно ли проверить иммунитет на эту реакцию перед началом лечения?

— Что такое коллективный иммунитет, и почему многие страны решили выбрать именно эту стратегию борьбы с вирусом?

— Что происходит в случае введения карантинных ограничений, к которым Узбекистан вернулся после апрельского режима, и есть ли в них смысл?

— О каких именно пациентах идет речь?

— Как вы, с позиции инфекциониста, оцениваете сами карантинные меры: ношение масок, перчаток, тоннели с хлором? Насколько они адекватные?

— Правда ли, что после перенесенного COVID-19 возможны сбои в работе иммунитета?

— Прокомментируйте, пожалуйста, интернет-советы про пользу «лимонада» из лимона и бикарбоната, а также сна на животе.

— Стоит ли сейчас покупать пульсоксиметры (приборы для измерения уровня кислорода в крови —

4 травы, которые естественным образом могут помочь укрепить вашу иммунную систему

Как травы могут принести пользу иммунной системе

1. Эхинацея

2. Чеснок

3. Женьшень

4. Рейши

Итог

Сравнение иммуностимулирующего действия лекарственных трав эхинацеи, ашваганды и брахми

Использование лекарственных растений в качестве иммуностимуляторов в аквакультуре: обзор

Основные моменты

Реферат

Ключевые слова

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

(PDF) Применение иммуностимуляторов на растительной основе в аквакультуре: обзор􀀁

Артикул | Ответ рыб на иммуностимулирующие диеты

Регулирование экспрессии воспалительных генов в PBMC с помощью иммуностимулирующих препаратов

Abstract

Введение

Материалы и методы

Препарат ботанический экстракт

Количественное определение эндотоксинов

Обработка клеток

Анализ микрочипов

Количественная ПЦР в реальном времени

Анализ проточной цитометрии

Результаты

Обсуждение

Вклад авторов

Список литературы

Иммуностимулирующая активность экстрагируемых водой полисахаридов из Cistanche deserticola в качестве растительного адъюванта in vitro и in vivo

Abstract

Введение

Материалы и методы

Животные

Экстракция водных экстрактов

Генерация РЦ

Обнаружение созревания ДК и активации Т-клеток

Лечение ингибитором TLR4

Протокол иммунизации

Тест на острую токсичность.

Обнаружение иммуномодулирующей активности WPCD

Обнаружение OVA-специфических антител

Обнаружение пролиферации спленоцитов и цитокинов

Оценка созревания ДК и Treg-клеток в селезенке

Статистический анализ

Результаты

WPCD способствует созреванию и функционированию BM-DC

WPCD способствует созреванию DC через путь TLR4

WPCD повышает гуморальный и клеточный иммунитет

WPCD стимулирует созревание DC и снижает частоту Treg

Оценка безопасности WPCD на мышах

Обсуждение

Благодарности

Список литературы

Добавить комментарий Отменить ответ